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胃癌是世界范围内最常见的恶性消化道肿瘤之一。中国每年约占全球发病病例的50%，已成为胃癌发病和死亡的重灾区。本研究以QTRAP-MS技术为主要分析平台，基于不同的研究目的，建立一套高效简便、灵敏度高、特异性强、重现性好的分析方法，并应用于胃癌细胞和血清代谢组学及抗肿瘤候选药物MDH-7的药代动力学研究，以期发现与胃癌诊断、治疗相关的代谢标志物群，开发具有自主知识产权的新型抗消化道肿瘤药物，这将对于临床胃癌的诊断、预防和治疗以及抗胃癌药物的研发具有十分重要意义。
1.优化LC-MS/MS条件和样品前处理方法，建立了高灵敏度、高选择性和高通量的拟靶标代谢组学方法。本方法涵盖了350个内源性代谢物MRM离子对，主要涉及氨基酸代谢、核苷酸代谢、糖酵解及TCA循环等能量代谢通路。该方法重现性好，动态线性范围宽，无需繁杂的数据预处理，特别是适合临床样本的高通量分析。以细胞和血清样本为研究对象，在正、负离子模式下对实验样本进行拟靶标分析。通过多元变量统计分析PCA、PLS-DA和OPLS-DA方法结合T检验筛选差异代谢物，采用MetaboAnalyst和KEGG对差异代谢物进行通路富集分析，MetaMapp结合CytoScape绘制较为全面综合的代谢网络图，受试者工作特征（ROC）曲线用于筛选特异性生物标志物。
2.运用所建立的拟靶标代谢组学方法研究了不同药物（激素和冬凌草甲素衍生物DG-7）作用胃癌细胞代谢组的影响，以期从代谢角度探索药物靶点和作用机制。激素诱导后的胃癌细胞在核苷酸代谢、氨基酸代谢、氨基酰-tRNA生物合成、糖酵解以及TCA循环上发生重要的代谢表型变化。有趣的是，经雌激素E2刺激的MGC-803和MKN45细胞发生很大的代谢变动；雄激素DHT刺激的MGC-803细胞发生明显的代谢变化，而雄激素DHT刺激的MKN45细胞几乎没有变化。随后，分别从不同作用时间和浓度梯度考察冬凌草甲素衍生物DG-7对MGC-803细胞代谢组的影响，综合比较发现，无论低剂量组（0.625μM）还是高剂量组（2.5μM）作用48小时后均发生明显的TCA循环代谢变动；高剂量组作用24小时发生明显的氨基酸代谢扰动，而低剂量组作用24小时未发生代谢变动，且两个剂量组中色氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢均受到显著影响。
3.运用所建立的拟靶标代谢组学方法研究了临床胃癌患者和健康人血清代谢组的差异性，以期发现胃癌转移和胃癌HER2阴性的潜在生物标志物。与健康对照组相比，胃癌转移组和胃癌HER2阴性组在血清代谢轮廓上均有显著变化且具有统计学意义。其中胃癌转移组有14个代谢物是上调的，30个代谢物是明显下调的；胃癌HER2阴性组有20个代谢物是上调的，39个代谢物是明显下调的。经ROC曲线分析，胃癌转移组筛选出5个高灵敏度和特异性的代谢物：邻氨基苯甲酸、8-羟基鸟苷、葡萄糖-6-磷酸、康酮糖-7-磷酸和乳清酸核苷-5’-磷酸；胃癌HER2阴性组筛选出4个高灵敏度和特异性的代谢物：8-羟基鸟苷、腺苷-5’-磷酸、果糖-6-磷酸和乳清酸核苷-5’-磷酸，这些代谢物具有成为胃癌是否转移或HER2阴性的潜在生物标志物。
4.利用UHPLC-QTRAP-MS技术分别建立不同代谢通路的精准靶向代谢组学方法，分别考察该方法学的定量限、线性、准确度、精密度、基质效应和稳定性等方面。结果表明，它们的线性回归方程相关系数（r2）均大于0.99，日内日间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于15％。运用所建的靶向代谢组学方法对弥漫型胃癌患者和健康人血清代谢物进行定量分析，血清中检测到23个氨基酸，14个核苷类物质，7个糖及有机酸。发现弥漫型胃癌患者在治疗过程中血清中大部分代谢物的浓度低于健康人的平均浓度水平，其中谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、腺苷-5’-磷酸和尿囊素的浓度水平发生显著变化，乳酸浓度水平显著低于健康人。
5.利用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术建立了灵敏、快速、简便的同时测定大鼠血浆中MDH-7和5-FU的定量分析方法，采用液-液萃取法处理血浆样品，以乙酸乙酯作为萃取剂。结果表明，该方法专属性和稳定性较好，无明显的基质效应，可以应用于大鼠经尾静脉注射给药后血浆样品中MDH-7和5-FU的含量测定。大鼠单独给药MDH-7后的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为5360.58±766.90ng/mL*h；半衰期t1/2为0.53±0.15h；清除率Cl为3.78±0.52L/h/Kg。大鼠单独给药5-FU后的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为3198.47±429.12ng/mL*h；半衰期t1/2为0.28±0.04h；清除率Cl为3.16±0.40L/h/Kg。大鼠联合给药后MDH-7的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为10266.58±3412.13ng/mL*h；半衰期t1/2为1.39±0.46h；清除率Cl为2.14±0.88L/h/Kg，大鼠联合给药后5-FU的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为3689.07±610.89ng/mL*h；半衰期t1/2为0.22±0.0.03h；清除率Cl为2.76±0.43L/h/Kg。结果表明，联合给药后5-FU明显影响MDH-7的药动学参数，5-FU的药动学参数无统计学变化。
6.利用UHPLC-QTRAP-MS技术建立了大鼠尿液中MDH-7及其代谢物的定性分析方法，尿液经固相萃取小柱（HLB）净化处理。采用QTRAP-MS技术特有的多离子反应监测-信息依赖采集-增强子离子（MRM/MIM-IDA-EPI）扫描模式和前体离子扫描-信息依赖采集-增强子离子（PREC-IDA-EPI）扫描模式联合分析大鼠灌胃给予MDH-7后尿液中的代谢产物。在尿液中找到10个可能的代谢产物，并对各个代谢物进行了结构表征，推测了MDH-7在大鼠体内可能的代谢途径，主要涉及脱乙酰化、羟基化、脱氟嘧啶环、氧化-脱氨和酰胺水解等代谢反应。
1.优化LC-MS/MS条件和样品前处理方法，建立了高灵敏度、高选择性和高通量的拟靶标代谢组学方法。本方法涵盖了350个内源性代谢物MRM离子对，主要涉及氨基酸代谢、核苷酸代谢、糖酵解及TCA循环等能量代谢通路。该方法重现性好，动态线性范围宽，无需繁杂的数据预处理，特别是适合临床样本的高通量分析。以细胞和血清样本为研究对象，在正、负离子模式下对实验样本进行拟靶标分析。通过多元变量统计分析PCA、PLS-DA和OPLS-DA方法结合T检验筛选差异代谢物，采用MetaboAnalyst和KEGG对差异代谢物进行通路富集分析，MetaMapp结合CytoScape绘制较为全面综合的代谢网络图，受试者工作特征（ROC）曲线用于筛选特异性生物标志物。
2.运用所建立的拟靶标代谢组学方法研究了不同药物（激素和冬凌草甲素衍生物DG-7）作用胃癌细胞代谢组的影响，以期从代谢角度探索药物靶点和作用机制。激素诱导后的胃癌细胞在核苷酸代谢、氨基酸代谢、氨基酰-tRNA生物合成、糖酵解以及TCA循环上发生重要的代谢表型变化。有趣的是，经雌激素E2刺激的MGC-803和MKN45细胞发生很大的代谢变动；雄激素DHT刺激的MGC-803细胞发生明显的代谢变化，而雄激素DHT刺激的MKN45细胞几乎没有变化。随后，分别从不同作用时间和浓度梯度考察冬凌草甲素衍生物DG-7对MGC-803细胞代谢组的影响，综合比较发现，无论低剂量组（0.625μM）还是高剂量组（2.5μM）作用48小时后均发生明显的TCA循环代谢变动；高剂量组作用24小时发生明显的氨基酸代谢扰动，而低剂量组作用24小时未发生代谢变动，且两个剂量组中色氨酸代谢，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢均受到显著影响。
3.运用所建立的拟靶标代谢组学方法研究了临床胃癌患者和健康人血清代谢组的差异性，以期发现胃癌转移和胃癌HER2阴性的潜在生物标志物。与健康对照组相比，胃癌转移组和胃癌HER2阴性组在血清代谢轮廓上均有显著变化且具有统计学意义。其中胃癌转移组有14个代谢物是上调的，30个代谢物是明显下调的；胃癌HER2阴性组有20个代谢物是上调的，39个代谢物是明显下调的。经ROC曲线分析，胃癌转移组筛选出5个高灵敏度和特异性的代谢物：邻氨基苯甲酸、8-羟基鸟苷、葡萄糖-6-磷酸、康酮糖-7-磷酸和乳清酸核苷-5’-磷酸；胃癌HER2阴性组筛选出4个高灵敏度和特异性的代谢物：8-羟基鸟苷、腺苷-5’-磷酸、果糖-6-磷酸和乳清酸核苷-5’-磷酸，这些代谢物具有成为胃癌是否转移或HER2阴性的潜在生物标志物。
4.利用UHPLC-QTRAP-MS技术分别建立不同代谢通路的精准靶向代谢组学方法，分别考察该方法学的定量限、线性、准确度、精密度、基质效应和稳定性等方面。结果表明，它们的线性回归方程相关系数（r2）均大于0.99，日内日间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于15％。运用所建的靶向代谢组学方法对弥漫型胃癌患者和健康人血清代谢物进行定量分析，血清中检测到23个氨基酸，14个核苷类物质，7个糖及有机酸。发现弥漫型胃癌患者在治疗过程中血清中大部分代谢物的浓度低于健康人的平均浓度水平，其中谷氨酰胺、赖氨酸、缬氨酸、鸟氨酸、腺苷-5’-磷酸和尿囊素的浓度水平发生显著变化，乳酸浓度水平显著低于健康人。
5.利用高效液相色谱-三重四极杆质谱联用技术建立了灵敏、快速、简便的同时测定大鼠血浆中MDH-7和5-FU的定量分析方法，采用液-液萃取法处理血浆样品，以乙酸乙酯作为萃取剂。结果表明，该方法专属性和稳定性较好，无明显的基质效应，可以应用于大鼠经尾静脉注射给药后血浆样品中MDH-7和5-FU的含量测定。大鼠单独给药MDH-7后的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为5360.58±766.90ng/mL*h；半衰期t1/2为0.53±0.15h；清除率Cl为3.78±0.52L/h/Kg。大鼠单独给药5-FU后的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为3198.47±429.12ng/mL*h；半衰期t1/2为0.28±0.04h；清除率Cl为3.16±0.40L/h/Kg。大鼠联合给药后MDH-7的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为10266.58±3412.13ng/mL*h；半衰期t1/2为1.39±0.46h；清除率Cl为2.14±0.88L/h/Kg，大鼠联合给药后5-FU的药动学参数：药时曲线下面积AUC(0–∞)为3689.07±610.89ng/mL*h；半衰期t1/2为0.22±0.0.03h；清除率Cl为2.76±0.43L/h/Kg。结果表明，联合给药后5-FU明显影响MDH-7的药动学参数，5-FU的药动学参数无统计学变化。
6.利用UHPLC-QTRAP-MS技术建立了大鼠尿液中MDH-7及其代谢物的定性分析方法，尿液经固相萃取小柱（HLB）净化处理。采用QTRAP-MS技术特有的多离子反应监测-信息依赖采集-增强子离子（MRM/MIM-IDA-EPI）扫描模式和前体离子扫描-信息依赖采集-增强子离子（PREC-IDA-EPI）扫描模式联合分析大鼠灌胃给予MDH-7后尿液中的代谢产物。在尿液中找到10个可能的代谢产物，并对各个代谢物进行了结构表征，推测了MDH-7在大鼠体内可能的代谢途径，主要涉及脱乙酰化、羟基化、脱氟嘧啶环、氧化-脱氨和酰胺水解等代谢反应。