目的由于早期症状不明显、发现晚、预后差,胰腺癌现已成为全球死亡率最高的恶性肿瘤之一。迄今为止,胰腺癌的临床治疗策略仍局限于手术切除、化疗和放疗等传统的治疗方法,治疗效果不理想,患者的5年生存率低于7%。因此,寻找更加有效的治疗策略对于胰腺癌的治疗至关重要。在过去几年,免疫治疗已经发展成为新的癌症治疗方法。例如,FDA已批准了针对程序性死亡蛋白1(Programmed cell death protein-1,PD-1)、程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(Cytotoxic T lymphpcyte associated antigen-4,CTLA-4)三个重要的免疫检查点抑制剂,用于多种癌症的治疗。不幸的是,尚未发现对胰腺癌患者行之有效的治疗方案。有研究报道,抗间皮素的单克隆抗体(mAb),包括抗间皮素免疫毒素SS1P(由酪氨酸蛋白激酶PTKB与假单胞菌外毒素PE38融合而成的可识别MSLN N端296-359区的单克隆抗体)和M0RAb-009(也称阿麦妥昔单抗)对胰腺癌治疗有效,但仍处于开发或临床试验阶段。近年来,靶向模式识别受体的免疫激活剂,因可以在肿瘤治疗中增强免疫细胞对肿瘤的识别和杀伤作用,逐渐成为肿瘤免疫治疗的热点。机体的固有免疫细胞通过模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)识别病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)和损伤相关分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)信号,从而启动不同的免疫应答,在调节机体稳态和宿主防御过程中发挥关键作用。近年来,PRRs逐渐成为临床疾病治疗的靶点,在抗肿瘤、抗感染中显示出良好的治疗潜力。其中,干扰素刺激基因(Stimulator of Interferon Genes,STING)是识别 DNA成分的关键胞内PRR,靶向cGAS-STING信号通路的STING蛋白激动剂,已在多种肿瘤的临床前研究和临床实验治疗中,展示出理想的治疗效果,成为包括癌症在内的许多与免疫相关的疾病的潜在的新型治疗策略。当外源性的DNA病毒、细菌以及自身损伤细胞的DNA进入细胞质时,易被APC(Antigen-presenting cells,APC)内的 DNA 感受器 cGAS 识别并催化环腺苷酸鸟苷酸(cyclic GMP-AMP,cGAMP)的产生。cGAMP作为第二信使可以与锚定在内质网上的STING蛋白结合,诱导STING分子的构象从单体变为二聚体,并通过高尔基体转运到核周微粒体,募集并激活TANK结合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1),进一步使干扰素调节因子 3(interferon regulatory factor 3,IRF3)磷酸化,诱导Ⅰ型干扰素的表达。由DC(dendritic cells,DC)产生的Ⅰ型IFN能够以旁分泌或自分泌的方式与自身或邻近DC或其他免疫细胞表面的干扰素受体结合,促进DC细胞的成熟,增强CD8+T细胞的抗肿瘤反应。研究证实,STING激动剂环二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)既能激活鼠源STING又能激活人源STING蛋白,不仅能够抑制B16黑色素瘤、4T1乳腺癌、CT26结肠癌、胰腺癌、皮肤癌以及B细胞淋巴瘤等多种类型肿瘤的增长,还能够抑制远端未治疗部位肿瘤的生长。另外,STING激动剂ML RR-S2 CDA(也被称作ADU-S100或MIW815)的临床实验显示总的客观有效率为5%,疾病控制率为32.5%。这意味着STING激动剂有望成为治疗胰腺癌的新型肿瘤免疫治疗药物。对于STING激动剂的抗肿瘤作用机制,以往研究认为STING激动剂主要激活APC中的STING信号通路,促进APC成熟,增强其抗原提呈能力,从而促进CD8+T细胞介导的抗肿瘤反应。但近年来也有文献表明,除APC外,STING蛋白也广泛表达于自然杀伤细胞(natural killer cells,NK)和肿瘤细胞。Marcus等人发现STING激动剂对NK敏感型肿瘤RMA-S淋巴瘤和B16BL6黑色素瘤的抗肿瘤作用主要是依赖于NK细胞而不是T细胞或B细胞,这为STING依赖性抗肿瘤免疫应答的机制提供了新的见解。然而,STING激动剂是否可以直接活化NK细胞、增强NK细胞的抗肿瘤活性?STING激动剂是否可以直接作用于肿瘤细胞促进NK细胞的活化?尚缺乏细致明确的研究。本论文试图探究将STING激动剂应用于胰腺癌的免疫治疗并探讨其机制。首先,为探究STING激动剂是否对NK细胞有直接的活化作用,我们使用STING激动剂2’-3’-cGAMP刺激NK-92细胞,我们发现:经2’-3’-cGAMP刺激的NK-92细胞内cGAS-STING信号通路发生活化,并且其表面的活化性受体表达上调,抑制性受体表达下调,从而使NK-92细胞对胰腺癌细胞的杀伤能力明显提高。同时,我们发现2’-3’-cGAMP能够直接激活胰腺癌细胞内cGAS-STING信号通路,促进IFN-β的产生,且明显诱导胰腺癌细胞表面NKG2DL的表达上调,从而增强胰腺癌细胞对NK细胞的杀伤敏感性。进而,我们观察了 STING激动剂体内抗肿瘤作用,我们建立了胰腺癌细胞AsPC-1皮下荷瘤小鼠模型,使用STING激动剂瘤内注射治疗后发现:STING激动剂能够诱导肿瘤细胞发生凋亡,并诱导肿瘤组织中IFN-β及趋化因子CCL5和CXCL10产生增加,明显抑制肿瘤的生长。综上所述,STING激动剂在NK-92细胞和胰腺癌细胞中的活化能够通过不同机制增强NK-92细胞对胰腺癌细胞的杀伤功能,这提示我们,STING激动剂联合NK细胞的治疗策略对于胰腺癌具有巨大的治疗潜力。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptors,CAR)是经基因工程修饰的具有特异靶向性的受体蛋白,可以靶向识别肿瘤细胞表面抗原。因此,为了进一步提高STING激动剂的治疗效果,我们将STING激动剂与课题组已建立的靶向间皮素的CAR-NK细胞联合对AsPC-1胰腺癌皮下荷瘤模型小鼠进行治疗,我们发现与单独使用CAR-NK细胞或STING激动剂的抑瘤效果相比,联合治疗的效果更加显著,且能够明显延长小鼠的生存期。我们的结果显示,STING激动剂可直接激活NK细胞、增强NK细胞的抗肿瘤活性,并证实STING激动剂联合靶向间皮素的CAR-NK细胞可明显改善NK细胞对胰腺癌的治疗效果,为胰腺癌的免疫治疗提供了新的思路和依据。方法1.通过RT-PCR法检测NK-92细胞和胰腺癌细胞AsPC-1细胞和Capan-2细胞表达STING基因的水平。2.通过Q-PCR法和ELISA法检测IFN-β的表达水平,通过Western blot法检测STING信号下游关键分子IRF3的磷酸化情况,以确定细胞内STING信号通路的活化情况。3.通过MTT法检测胰腺癌细胞的增殖情况,利用流式细胞术,通过Annexin V-PI双染色法检测胰腺癌细胞的凋亡情况。4.通过Q-PCR法和ELISA方法分别从基因水平和蛋白水平检测AsPC-1和Capan-2细胞表达趋化因子CCL5和CXCL10的水平;通过Q-PCR法检测两种细胞表面NKG2D配体的表达情况。5.通过流式细胞术及免疫组化法检测AsPC-1和Capan-2细胞表达间皮素的水平。6.建立anti-MSLN-CAR-NK-92细胞,通过LDH方法检测NK细胞及CAR-NK细胞对AsPC-1和Capan-2细胞的杀伤活性,以验证CAR-NK细胞的效应功能。7.建立AsPC-1胰腺癌皮下荷瘤小鼠模型,瘤内注射STING激动剂,观察小鼠肿瘤的生长情况;使用TUNEL法检测小鼠肿瘤组织的凋亡情况;使用Q-PCR法检测肿瘤组织IFN-β及趋化因子CCL5和CXCL10的表达水平。8.建立AsPC-1胰腺癌皮下荷瘤小鼠模型,瘤内注射STING激动剂联合尾静脉转输anti-MSLN-CAR-NK-92细胞治疗,观察肿瘤的生长情况和小鼠生存期。结果1.NK-92细胞表达STING基因。STING激动剂2’-3’-cGAMP能够激活NK-92细胞中STING信号通路,促进下游关键分子IRF3发生磷酸化,并呈时间依赖性增强;IFN-β的产生在基因水平有明显的上调。2.NK-92细胞经2’-3’-cGAMP刺激之后,细胞表面活化性受体(NKG2D、NKG2C、NKp44和NKp46)的表达明显上调,抑制性受体(NKG2A、TIGIT和PVRIG)的表达下调。3.胰腺癌细胞AsPC-1和Capan-2表达STING基因。2’-3’-cGAMP能够激活AsPC-1和Capan-2细胞中STING信号通路,促进下游关键分子IRF3的磷酸化,并呈时间依赖性增强,IFN-β的产生在基因水平和蛋白水平上均有明显的上调。4.2’-3’-cGAMP处理可浓度依赖性地诱导胰腺癌细胞AsPC-1和Capan-2细胞增殖活性下降,凋亡细胞比例增加。5.2’-3’-cGAMP能够明显诱导胰腺癌细胞表面NKG2DL的表达上调,在基因水平和蛋白水平上促进趋化因子CCL5和CXCL10的产生。6.胰腺癌细胞AsPC-1和Capan-2表达高水平的间皮素(MSLN)。7.成功建立靶向间皮素的CAR-NK-92(anti-MSLN-CAR-NK-92)细胞,anti-MSLN-CAR-NK-92细胞对AsPC-1细胞和Capan-2细胞的杀伤能力明显高于未修饰的NK-92细胞。8.成功建立胰腺癌细胞AsPC-1皮下荷瘤小鼠模型,STING激动剂2’-3’-cGAMP瘤内注射治疗能够诱导肿瘤组织发生凋亡,并诱导肿瘤组织中IFN-β及趋化因子CCL5和CXCL10的产生增加,明显抑制肿瘤的生长。9.联合STING激动剂与靶向间皮素的CAR-NK细胞治疗AsPC-1胰腺癌皮下荷瘤模型小鼠,显示出较单一治疗组更明显的治疗效果,明显抑制肿瘤生长并延长小鼠的生存期。结论1.STING激动剂2’-3’-cGAMP对NK细胞具有直接的激活作用,能够增强NK-92细胞对胰腺癌细胞的杀伤活性。2.2’-3’-cGAMP能够激活胰腺癌细胞内cGAS-STING信号通路,促进NKG2D配体的表达,从而增强胰腺癌细胞对NK细胞杀伤的敏感性。3.STING激动剂能够直接抑制胰腺癌细胞增殖、诱导胰腺癌细胞凋亡。4.STING激动剂联合靶向间皮素的CAR-NK细胞可明显改善NK细胞对胰腺癌的治疗效果,有望成为胰腺癌免疫治疗的新策略。