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精氨酸作为一种功能性氨基酸,需要通过相应的转运载体进入细胞内,发挥其在鱼类的生长、免疫及肠道黏膜等方面的重要作用。鱼类肠道作为维持机体内环境稳定的一道重要屏障,对机体的防御系统意义重大。因此,精氨酸的吸收转运及对鱼类肠道物理和免疫屏障的系统研究具有重要意义。本文从珍珠龙胆石斑鱼肠道精氨酸的吸收转运机制入手,探讨其对肠道物理屏障和免疫屏障的影响。主要的研究结果如下:1.为了探究精氨酸在肠道的吸收转运机制,运用c DNA末端快速扩增(RACE)技术克隆得到珍珠龙胆石斑鱼碱性氨基酸转运载体CAT1基因(SLC7A1)c DNA的全长序列,并且应用实时荧光定量PCR技术对CAT1基因在珍珠龙胆石斑鱼不同组织中的表达进行检测。结果显示,CAT1基因序列全长2319bp,其中开放阅读框(ORF)为1938bp,编码645个氨基酸,5’-UTR为208bp,3’-UTR为173bp,预测其相对分子量为69.7KDa,理论等电点5.31。多序列比对结果显示珍珠龙胆石斑鱼CAT1基因与其他物种的CAT1具有较高的保守性。SMART软件对CAT1 c DNA进行蛋白质序列分析,发现它包含14个跨膜区。实时荧光定量PCR数据分析表明,该基因在珍珠龙胆石斑鱼后肠、脑、体肾、前肠、中肠、心脏、头肾、皮肤、鳃、肌肉、胃和脾脏这12种组织中都有表达,在后肠表达量最高,肝脏中不表达。2.为探究精氨酸对珍珠龙胆石斑鱼生长、饲料利用、体组成成分和肠道抗氧化能力的影响,配制3种精氨酸水平(1.96%、3.06%、3.74%干物质)的等氮等脂实验饲料。随机挑选初重为20.79±0.04g的珍珠龙胆石斑鱼分成3组,每组5个重复,每个重复25尾鱼,进行为期6周的养殖实验。结果表明:饲料精氨酸对珍珠龙胆石斑鱼的存活率(SR)无显著影响(P>0.05)。饲喂含3.06%精氨酸饲料组的增重率(WGR)、特定生长率(SGR)、蛋白质效率(PER)和肥满度(CF)均显著高于1.96%和3.74%组(P<0.05),饲料系数(FCR)显著低于1.96%和3.74%组。在体成分方面,精氨酸对全鱼粗蛋白,粗脂肪、粗灰分以及肌肉氨基酸含量无显著影响(P>0.05)。与1.96%和3.74%组相比,3.06%组石斑鱼肠道谷胱甘肽(GSH)含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活性显著升高(P<0.05);3.06%组石斑鱼肠道谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)和过氧化氢酶(CAT)活性均显著高于1.96%组(P<0.05);3.06%组与1.96%组石斑鱼肠道总抗氧化能力(T-AOC)无显著性差异(P>0.05),显著高于3.74%组(P<0.05);3.06%组石斑鱼肠道丙二醛(MAD)含量显著低于1.96%组和3.74%组(P<0.05)。石斑鱼肠道总一氧化氮酶(TNOS)活性和NO含量均随着饲料精氨酸水平的增加而增加(P<0.05)。3.饲料精氨酸水平对珍珠龙胆石斑鱼肠道免疫屏障及抗病力的研究结果显示,肠道TLR22和热休克蛋白70(Hsp70)m RNA在3.06%组的相对表达水平显著低于1.96%和3.74%组(P<0.05)。IL-1β和TNF-α基因在3.06%和3.74%组石斑鱼肠道中的表达无显著差异(P>0.05),显著低于1.96%组(P<0.05)。3.06%组石斑鱼肠道TGF-β和IL-10 m RNA的相对表达水平显著高于1.96%和3.74%组(P<0.05)。注射哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)后第16h(hour post-injection,hpi),各处理组的肠道TLR22和My D88 m RNA表达水平均达到最高值(P<0.05),且在16hpi 3.06%组TLR22和My D88 m RNA表达水平最低(P<0.05)。1.96%、3.06%和3.74%组最高的石斑鱼肠道TGF-βm RNA表达水平分别出现在12hpi、8hpi和4 hpi。各组肠道IL-10 m RNA表达水平均在12hpi达到最大值。攻毒后的3.06%组肠道TGF-β和IL-10 m RNA表达水平均显著高于1.96%和3.74%组(P<0.05)。4.饲料精氨酸水平对珍珠龙胆石斑鱼肠道形态、物理屏障及肠细胞凋亡的影响。结果表明,饲料精氨酸对肠道绒毛高度和肌层厚度有显著影响。3.06%组的石斑鱼肠道绒毛高度显著高于其它组(P<0.05)。3.06%组石斑鱼肠道肌层厚度和3.74%组无显著差异(P>0.05),显著高于1.96%组(P>0.05)。TUNEL染色结果表明,与3.06%组相比,1.96%组和3.74%组肠道凋亡细胞数量增加。在转录水平上,3.06%组鱼肠道caspase3和p53基因表达均低于1.96%和3.74%组(P<0.05)。1.96%组和3.06%组肠道caspase9基因表达显著低于3.74%组(P<0.05)。3.06%组的石斑鱼肠道紧密连接蛋白claudin3,claudin12,claudin15a及ZO-1m RNA表达水平均显著高于1.96%组和3.74%组。综上,饲料精氨酸可以上调珍珠龙胆石斑鱼肠道抗氧化能力及免疫力,降低肠道细胞的凋亡并可能通过PI3K/Akt/TOR通路调控肠道紧密连接蛋白,增强珍珠龙胆石斑鱼肠道免疫与物理屏障,促进鱼体健康生长。