研究背景:DNBSEQ高通量测序技术广泛应用于科研和临床领域,包括全基因组测序（whole-genome sequencing,WGS）、全外显子组测序（whole-exome sequencing,WES）以及特殊靶向区域的测序（panelsequencing）。随着高通量测序技术的迅速发展以及在肿瘤等疾病研究中的应用,人们对突变精准检测的要求变得越来越高,特别是低频突变的精准检测。但是由于样本类型、测序深度等条件的限制,过滤假阳性突变并且准确识别样本的真实低频突变仍是一个很大的挑战,因此通过一些有效的方法提高低频突变的精准检测显得尤为重要。研究目的:本文对DNBSEQ高通量测序技术下可以提高低频突变精准检测的方法进行了探索和研究,包括特殊的双端唯一标签（unique dual barcode,UDB）、分子标签（unique molecular identifier,UMI）以及测序深度。方法:首先,对32个已知序列的DNA片段进行单barcode和UDB文库制备并混合上机测序,对比两种文库的污染率（标签跳跃）。其次,利用分子标签（UMI）对理论突变频率分别为1%、0.5%和0.2%肺癌循环肿瘤DNA（Circulating tumor DNA,ctDNA）标准品以及8名宫颈癌患者的ctDNA进行变异检测分析,分析UMI技术对真实低频突变检出的影响。最后,通过对理论突变频率为3%的NA12878、理论突变频率分别为1%、3%和5%的ctDNA标准品以及源自C57BL/6小鼠的配对的冷冻组织（fresh-frozen,FF）和福尔马林固定石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded,FFPE）的DNA进行高深度测序,分析了不同测序深度对低频突变频率保真度及灵敏度的影响,对测序深度标准化模型的建立进行了研究。结果:1.UDB技术在解决样本串扰方面比单barcode更有优势,单barcode样本间的串扰（即污染率）为0.058%,而UDB的则显著下降可低至0.0063%,极大的降低了对低频突变检测的干扰。2.使用UMI技术对理论突变频率为1%、0.5%和0.2%的ctDNA标准品进行变异检测分析时,去除了假阳性突变背景的干扰,提高了检测的准确度。真实突变的检出率分别为100%（7/7）,85.7%（6/7）和83.3%（5/6）,而且宫颈癌术前术后ctDNA突变数量的变化以及ctDNA与组织的突变检测一致性情况证明了 UMI技术在临床的应用价值。3.基于二项式分布建立起不同低频突变-测序深度-灵敏度的标准化关系,阐明了测序深度与实际检测突变频率保真度的关系。理论突变频率分别为3%的NA12878以及1%、3%和5%的ctDNA标准品中,实际检测突变频率围绕理论突变频率规律性波动,测序深度越高,实际检测突变频率的波动越小且更趋近理论突变频率值即保真度提高,进而提高了检测灵敏度。用小鼠样本对上述规律进行验证,当提高FF和FFPE真实样本的深度时,二者突变的一致性亦有显著提升。结论:1.UDB技术极大程度上解决了样本的串扰问题,为低频突变的精准检测奠定基础。2.UMI技术可以准确分辨样本中的真实突变和假阳性突变,提高低频突变检测的精准度。3.测序深度的提高增加了低频突变频率的保真度以及检测的灵敏度,而测序深度的标准化有助于低频突变的精准检测。