内生真菌（endophytic fungi）是指那些在其生活史中的大部分或全部时期生活在植物组织内，对植物形成不明显侵染的一类真菌。近来研究证据表明，内生真菌不但种类丰富，其次级代谢产物更是类型繁多，生物活性多样，包括抗肿瘤、抗菌、抗病毒、杀虫等活性。内生真菌以其独特的资源和结构多样性优势，成为人们寻找新的生物活性物质的重要途径。构树Broussonetia papyrifera (L.)Vent.为桑科构属植物，分布广泛，具有药用、食用、材用等多种用途。根、枝、叶和种子等均可入药。其干燥成熟的果实作药用，中药名称为“楮实子”（Fructus Broussonetiae），始载于《名医别录》，具有滋肾清肝、明目、利尿等功效，文献及本课题组前期研究还表明其提取物有抗肿瘤活性。近来国内外的一些研究结果表明，特殊生境下植物内生真菌往往可能产生结构新颖、功能独特的次级代谢物。基于此，我们在前期研究的基础上，对重金属胁迫下的构树进行了内生真菌的分离，并对构树内生真菌的生物活性和重金属抗性进行筛选研究，以期寻找到有药用价值或环境修复价值的内生真菌。最后，我们重点对其中两株具有抗肝癌活性的菌株进行化学成分分离、鉴定和抗癌活性复筛。本研究主要包括以下三部分内容：一、构树内生真菌的重金属抗性研究1.以采自南京栖霞铅锌矿区的新鲜构树根、茎和叶为研究对象，通过组织分离法，共分离纯化了47株构树内生真菌，其中构树叶的内生真菌分离率达到0.91，结果显示，构树内生真菌具有丰富的生物多样性，是一个的潜在的内生真菌资源库。2.对本课题分得的47株内生真菌及本课题组前期分得的48株内生真菌进行重金属Zn、Pb和Cu耐受性研究。结果显示，其中5株菌对重金属的耐受性较好，在Zn浓度为200mmol/L时仍能生长，它们分别为Apiosporamontagnei， Arthrinium phaeospermum， Aspergillus sp.， Stagonosporopsiscucurbitacearum，Eyronellaea australis。二、构树内生真菌的生物活性研究1.以小鼠巨噬细胞系RAW264.7为体外抗炎模型，对部分内生真菌的发酵产物进行抗炎活性筛选，结果显示，在发酵产物浓度为100ug/mL时，18株菌能显著降低LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞NO的生成量，14株构树内生真菌发酵产物能完全抑制炎症细胞的生长，我们推测可能由细胞毒性所致。2.以人肝癌细胞系SMMC-7721和QJY7703为体外抗肿瘤筛选模型，采用MTT法，对部分内生真菌的发酵产物进行抗肿瘤活性筛选。其中5株内生真菌表现出较好的抗肝癌活性，分别为Chaetomium globousm, Fusariumsp., Gibberella intermedia, Alternaria sp.和一株未鉴定菌。三、两株构树内生真菌的次级代谢产物及其抗肿瘤活性研究1.选取其中的2株（Chaetomium globousm和Alternaria sp.）抗肝癌活性较好的内生真菌进行大量发酵。以发酵物的乙酸乙酯部位为研究对象，采用常压柱层析、薄层层析和半制备液相等技术从两株菌中共分离得到36个单体化合物，并应用理化常数测定和质谱、光谱（UV、IR、NMR）等分析技术鉴定了21个化合物的结构，其中2个新化合物，1个新的天然产物。从菌株Alternaria sp.分离鉴定的11个化合物中有2个萘醌类、6个间苯二酚类、2个苝醌类和1个甾体类化合物，其中苝醌altertoxin IV为新化合物。从菌株Chaetomium globousm分离鉴定了10个化合物，包括4个甾体类、4个细胞松弛素类、2个Azaphilone色素类化合物，其中甾体15β-羟基-(22E,24R)-麦角甾-3,5,22-三烯-7-酮为新化合物。2.采用MTT法，对部分单体成分进行抗肿瘤活性研究，以SMMC-7721、A549、MG-63等肿瘤细胞系为体外抗肿瘤筛选的模型，筛选了其中16个单体成分的抗肿瘤活性。结果显示化合物链格孢素A、链格孢素C、3,4’,5’-trihydroxy-5-methoxy-7H-benzo[c]chromen-7-one、 isochaetoglobosin D、chaetoglobosin G有较好的抗肿瘤活性。通过以上研究可以得出结论，构树内生真菌具有丰富的生物多样性，是一个潜在的内生真菌资源库，尤其是在重金属胁迫下，其内生真菌与其宿主植物一样具有较强的重金属耐受性。此外，构树内生真菌还能产生具有抗肿瘤活性的次级代谢产物，可望成为抗肿瘤天然活性产物的新资源。