猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的高度接触性传染病，其以腹泻、呕吐、脱水为主要症状。PED的世界内流行，给养猪业造成巨大的经济损失。PEDV S蛋白为纤突蛋白，位于病毒粒子表面，在病毒体外的繁殖、基因组的多样性以及遗传变异的过程中起重要作用，是临床诊断及疫苗研制的首选靶蛋白。PEDV S蛋白可划分为S1(1-789 aa)区和S2(790-1383 aa)区。在S1区存在一个PEDV的重要抗原表位区(499-638 aa)命名为COE基因，该基因作为靶基因应用于基因工程疫苗的制备之中。　　脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus，EMCV)是小RNA病毒科，心病毒属的成员，其基因组为单股正链RNA。猪源EMCV主要引起仔猪急性心肌炎，死亡率可达100％;感染母猪主要表现为繁殖障碍。由于EMCV宿主广泛，不仅对养猪业造成严重的经济损失，而且能够跨种间传播，EMCV公共卫生学意义已愈来愈受到人们的关注。随着反向遗传操作技术的发展，单股正链RNA病毒作为基因工程疫苗的活载体成为可能。利用EMCV为载体，构建表达PEDV COE蛋白的重组病毒，以期达到一苗防两病的目的。　　本研究以EMCV HB10株为亲本毒，采用RT-PCR的方法一次性扩增EMCV全长cDNA，并克隆至pBluescript SK II载体中，构建成重组载体(pBSK-rEMCV)。pBSK-rEMCV经体外转录出基因组RNA，转录产物转染BHK21细胞进行病毒的拯救。经RT-PCR、Western Blot及测序鉴定等方法，证明成功拯救出rEMCV。同时，拯救出的rEMCV保持了亲本毒HB10在BHK21细胞上的生长特性。构建的EMCV全长感染性cDNA克隆，为EMCV的分子致病机理、疫苗构建、基因功能等病毒分子生物学研究提供了有力的工具。　　在此基础上，构建了表达PEDV COE蛋白的重组脑心肌炎病毒株(rEMCV-COE)。采用融合PCR的方法，将COE基因插入EMCV基因组中，构建成重组载体(pBSK-rEMCV-COE)。pBSK-rEMCV-COE经体外转录出带有COE基因的EMCV基因组RNA，转录产物转染BHK21细胞进行重组病毒rEMCV-COE的拯救。经RT-PCR、Western Blot、间接免疫荧光(IFA)及测序鉴定等方法，证明拯救出rEMCV-COE。一步生长曲线结果表明，rEMCV-COE在BHK21细胞上表现出良好适应性和稳定性。rEMCV-COE按101TCID50/只的剂量经肌肉注射接种小鼠。分别在免疫后3d，7d，14d，21d，28d，采血，测定EMCV和PEDV的抗体效价。结果小鼠在免疫后14d后产生的抗EMCV和PEDV的抗体达到峰值。构建的pBSK-rEMCV-COE为EMCV和PEDV二联活载体疫苗的开发提供参考。