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烟草（Nicotiana tabacum L.）是以烟叶为主要经济部位的茄科作物。烟叶中氮素流向决定了其含氮化合物的组成,而烟叶中含氮化合物与烤烟品质密切相关。烟草中转运到烟叶的氮素储存于叶片细胞的不同细胞结构以及一些游离的含氮化合物当中,这种分配方式决定了叶片光合作用的强弱,影响叶片的坚韧程度以及化学防御强度,因此研究氮素在烟草叶片中的流向具有重要意义,也成为当前植物科学研究的热点之一。本研究前期采用超高效液相色谱与串联四极杆飞行时间质谱（Ultra Performance Liquid Chromatography-Quadrupole-Time Of Flight-Mass Spectrometry,UPLC-Q-TOF-MS）和气相色谱-质谱联用（Gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）技术建立烟叶中含氮化合物分析体系。利用RNA测序技术（RNA Sequencing,RNA-Seq）从不同栽培措施下控制烟叶氮素分配流向的候选基因中筛选出了NtHB6。本研究对NtHB6的基因序列、亚细胞定位和转录活性进行了分析;构建了NtHB6的超量表达载体、干扰载体和CRISPR/Cas9基因编辑载体并遗传转化烤烟品种K326。通过对烟草转基因株系的表型鉴定,及对NtHB6超量表达植株和对照植株转录组的比较分析,对NtHB6调控烟草抗旱、叶片氮素流向和早花表型的调控机理进行了初步分析。主要研究结果如下:1、NtHB6转录因子表达载体构建、亚细胞定位以及转录活性探究本研究从烟草中克隆了NtHB6基因的编码区序列（Coding sequence,CDS）,共1026 bp。构建了pEarley Gate101-HB6超量表达载体、RNAi-p FGC5941M-HB6干扰载体和CRISPR/Cas9-HB6基因编辑载体。本研究使用pEarley Gate101-HB6超量表达载体检测NtHB6蛋白的亚细胞定位。超量表达载体所携带的EYFP增强型黄绿色荧光标签在烟草原生质体中表达后,通过激光共聚焦显微镜观察到与核荧光重合,证明NtHB6转录因子是细胞核定位。本研究将拟南芥At HB6和At HB16的绑定基序分别进行串联重复,构建双荧光素酶报告基因载体,分别与pEarley Gate101-HB6超量表达载体共转本氏烟草进行瞬时表达,利用试剂盒测定其双荧光素酶活性。结果表明NtHB6转录因子具有转录激活活性,可与拟南芥At HB6和At HB16的绑定基序CAATCATTAAT和TAATAATT结合,使载体上的荧光素酶报告基因得到表达,从而增强了LUC荧光素酶的活性,使得LUC/REN的比率显著升高。2、NtHB6转录因子调控烟草抗旱机制的初步研究盆钵土培干旱胁迫处理试验发现,超量表达株系在光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率等方面都显著高于其他类型烟草。经PEG处理的培养基干旱模拟胁迫试验结果表明,在对照组中超量表达株系和K326株系的表型差异最大。通过对室内各烟草株系RNA-Seq分析,筛选出了TCTP、TPC1和CCR2三个基因。推测NtHB6可能通过直接或间接调控上述三个基因的表达,进而调控烟草干旱胁迫的适应过程。3、NtHB6调控烟草叶片氮素流向的功能研究对NtHB6超量表达株系和K326株系进行了氮素处理水培试验。结果表明,氮素含量对NtHB6在烟草中的表达具有调控作用;富氮处理组和CK组中NtHB6超量表达株系的SPAD值显著高于K326对照株系。为了找出调控烟叶氮素流向相关的基因,本研究分别对大田和室内栽培的转基因及K326株系进行了RNA-Seq。结果表明,NtHB6直接或间接的参与调控烟草叶片氮素流向途径中不同种类氨基酸的合成、修饰和代谢过程。代谢组分析结果表明,NtHB6超量表达株系和K326对照株系在生物碱、氨基酸和有机酸等化合物中的含量存在显著差异。其中,NtHB6超量表达株系的4种生物碱（烟碱、降烟碱、假木贼碱、新烟草碱）、咖啡酸和谷氨酰胺含量均极显著高于K326株系。此外,通过扫描电镜观察发现,NtHB6超量表达株系叶面表皮细胞间的分泌物明显多于K326对照株系。自然感蚜试验结果表明,NtHB6基因编辑株系对蚜虫易感,K326对照株系生长前期不易感后期易感蚜虫,而NtHB6超量表达株系则对蚜虫不易感。4、NtHB6调控烟草早花现象发生和生殖系统发育的功能探究NtHB6超量表达株系烟草的早花现象首先在T0代的盆钵种植过程中被发现,随后在大田栽培试验中得到验证。从记录的转基因株系和K326株系的开花时间对比后发现,转基因烟草株系相较于K326株系平均开花时间提前了6.5天。在室内烟草转录组数据中鉴定出63个控制开花相关基因,而在大田烟草转录组数据中鉴定出462个控制开花相关基因。室内种植烟草相比于大田烟草的开花时间提前14-20天,在室内种植烟草中,NtHB6超量表达株系比K326株系平均开花时间只提前约3.1天。推测造成差异的原因为:NtHB6对开花时间的调控可能还受到光周期、光强、蓝光和昼夜节律等环境因素影响。5、NtHB6转录因子的下游调控网络分析本研究利用大田和室内栽培的NtHB6超量表达植株和对照植株的转录组数据,根据其启动子序列中的结合基序,从差异表达基因中筛选NtHB6的下游基因。筛选出启动子中含有绑定基序CAATCATTAAT和TAATAATT的基因共25个。推测NtHB6可能调控这些基因的表达,进而调控烟草叶片不同氮代谢初级和次级产物合成,对碳氮分配可能也具有一定的作用。NtHB6超量表达转基因植株下调表达基因中存在大量与生长发育及开花时间相关的基因,NtHB6可能是生长发育和开花时间的负调节因子,通过降低细胞分化及开花时间抑制因子的表达,间接促进烟草植株快速生长,提高其生物量,并促使烟草植株提前开花。此外,其下调表达基因也一定程度上参与氮代谢物质的调节,通过调控芳香氨基酸家族和胺代谢过程实现对烟草叶片氮素流向的调节。