【摘 要】
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猪(Sus scrofa)不仅是重要的农业动物,在探究骨骼肌生长发育和其他人类相关疾病的分子机制方面也是重要的模式动物。骨骼肌形成是动物生长发育过程中极其重要的步骤,其中TMEM8c(也叫Myomaker,MYMK)作为一种肌肉特异性跨膜蛋白,能显著促进成肌细胞融合,在骨骼肌正常发育中发挥关键作用,该结果已在多个物种中得到验证,但是Myomaker对猪(Sus scrofa)成肌细胞融合的作用以及
【基金项目】
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国家重点研发计划(项目编号:2018YFD0501204,2018YFD0500403); 国家自然科学基金(项目编号:31601918,31530073,31772576); 国家生猪产业技术体系(项目编号:CARS-35-01A); 四川省科技支撑计划(项目编号:2016NYZ0042,201
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猪(Sus scrofa)不仅是重要的农业动物,在探究骨骼肌生长发育和其他人类相关疾病的分子机制方面也是重要的模式动物。骨骼肌形成是动物生长发育过程中极其重要的步骤,其中TMEM8c(也叫Myomaker,MYMK)作为一种肌肉特异性跨膜蛋白,能显著促进成肌细胞融合,在骨骼肌正常发育中发挥关键作用,该结果已在多个物种中得到验证,但是Myomaker对猪(Sus scrofa)成肌细胞融合的作用以及分子调控机制尚不清楚。因此,本试验采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测Myomaker在猪骨骼肌生长发育和原代成肌细胞融合过程中的表达情况,并通过免疫荧光试验研究Myomaker过表达对成肌细胞融合的影响;利用3’RACE(3’Rapid Amplification of c DNA Ends)技术扩增出猪Myomaker的3’UTR序列,结合双荧光素酶报告系统筛选出对Myomaker具有靶向调节作用的miRNAs,并验证miRNAs对成肌细胞融合的影响;最后通过构建猪骨骼肌损伤模型研究Myomaker在骨骼肌再生过程中的表达情况。本研究主要结果如下:(1)RT-PCR结果显示,Myomaker在长白猪骨骼肌组织中的表达水平极显著高于其他组织(心、肝、脾、肺、肾和皮肤)(P<0.01),胚胎时期(E85、E113、D0)的表达量极显著高于出生后(D180、D270、Y2)(P<0.01),且免疫印迹(Western blot)结果与RT-PCR结果相一致;从长白猪的背最长肌中成功分离出原代肌卫星细胞(muscle satellite cells,MSCs)并诱导其分化,结果显示在细胞分化过程中Myomaker的表达呈现上升趋势,且在分化第四天其表达量达到峰值,之后开始降低。(2)Myomaker功能验证结果显示,Myomaker过表达后促进多核肌管的形成,肌管融合指数显著上升(P<0.05),说明Myomaker能促进猪成肌细胞融合,形成多核肌管。(3)通过MEGA6.0软件构建了Myomaker氨基酸进化树,并利用3’RACE技术成功扩增出猪Myomaker的3’UTR序列。(4)Targetscan、RNAhybrid和双荧光素酶报告系统表明miR-205能与Myomaker 3’UTR靶向结合;miR-205功能验证显示,miR-205过表达能显著抑制Myomaker的表达以及成肌细胞融合(P<0.05);此外,成肌分化标志基因中Myo G的表达量也受到抑制(P<0.05)。(5)成功构建了猪的骨骼肌损伤模型;在骨骼肌修复过程中,Myomaker表达被激活,在损伤第五天其表达量达到峰值,且出现大量新生肌纤维;此外,肌源性转录因子Myo D、Myo G和Myf5的表达模式与Myomaker类似。综上所述,本研究发现Myomaker在猪成肌细胞融合和骨骼肌再生过程中发挥作用,并证明miR-205通过靶向调节Myomaker表达抑制成肌细胞融合。
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