随着核能在军事领域和民用领域中的普及应用,其在巨大造福人类的同时,也给公众的健康和安全带来了严峻的挑战。1954年发生在日本广岛和长崎的原子弹爆炸,1986年在前苏联切尔诺贝利核电站事故,以及最近在日本福岛第一核电站的事故等,都给人类造成了重大灾难和巨大社会影响。我国是一个核大国,在军事方面拥有大量核弹、核动力舰艇等战略核武器,在民用方面也拥有多座核电站,从1991年秦山一期核电机组并网发电,到目前已有浙江秦山,广东大亚湾/岭澳和江苏田湾电站共11个核电机组投入商业运行,总装机容量达912万千瓦,预计2020年我国核电总量将建成4000万千瓦,2035年核电装机容量将达到15000万千瓦,这些意味着辐射工作人员和核设施周边覆盖的公众将大幅度增加,我们也面临着核安全方面的考验。然而,关于对大剂量照射核事故伤员的救治方面的研究,目前最成功的方法是造血干细胞移植,但这种方法存在造血干细胞配型率低,来源困难和远期效果不理想等问题。所以开发一种容易生产,使用方便,治疗效果明显的辐射损伤治疗药物或新途径,作为一种战略技术储备迫在眉睫。近些年来,国外学者在研究Toll样受体及其激动剂时,取得了令人不可思议的发现。2008年Burdelya LG等在Science杂志上报到了利用改良型Toll like receptor 5 （TLR5）激动剂（一种沙门氏菌毛蛋白）激活TLR5信号分子,具有极强的减轻辐射损伤效应,并且在实验中发现即使在照射后2小时给予药物仍然有较好的减轻辐射损伤效果,认为TLR5激动剂介导的减轻辐射损伤作用的主要途径是通过活化NF-κB （nuclear factor kappa B）实现。这提示Toll样受体家族成员（Toll Like Receptors TLRs）及其激动剂在辐射损伤治疗方面有着广泛的研究前景。Burdelya LG等的发现无疑为研究辐射损伤治疗剂开辟了一个新的领域。TLRs家族成员属于进化比较保守的模式识别受体（Pattern Recognition Receptor, PRR）能够识别病原微生物的相关分子模式（Pathogen Associated Molecular Patterns,PAMPs）。Toll蛋白是由Hashimoto等人于1988年首次在果蝇体内发现,随后Jules A Hoffmann发现Toll蛋白介导果蝇的天然免疫,特别是可以抑制果蝇的真菌感染,它能感受入侵的病原体,使果蝇分泌多种抗微生物感染的多肽以清除病原体。1997年Medzhitov通过同源性分析首次在人体内分离出果蝇Toll蛋白的同系物,称为人类Toll蛋白。开启了哺乳动物中TLRs与免疫系统研究的序幕。迄今,免疫学家已在哺乳动物中发现了11中TLR,并分别命名为TLR1～11,他们均为I型跨膜蛋白,其共同的结构特点是膜外具有富亮氨酸重复序列,膜内是一段结构保守的区域,为细胞内信号转导的起始部位。TLRs识别的PAMPs是一类高度保守的分子结构,这些PAMPs分子结构存在于病原体内。TLRs与PAMPs互相作用启动免疫反应,激活机体的天然免疫系统,不同TLRs识别的PAMPs也有差异,如TLR1、2、4和6识别病原体的脂类部分;TLR5识别病原体的蛋白质分子:TLR3、7、8和9识别病原体的核酸分子。鉴于TLRs家族成员的结构,信号转导通路和生物活性等大部分方面有共同相似之处,从理论上分析TLRs的其他家族成员可能也有辐射损伤治疗效果,甚至效果更为显著。TLR9是TLRs家族的重要成员之一,其PAMP激动剂为CpG-ODN。CpG-ODN被胞吞进入细胞,与细胞质中的TLR9相互作用形成复合物,并通过髓样分化因子（myeloid differentiation factor 88, MyD88）依赖的信号通路激活免疫应答。MyD88和肿瘤坏死因子受体相关因子6（the TNF receptor associated factor, TRAF6）激活NF-κB诱导激酶,继而激活NF-κB抑制物激酶,导致IκB （Inhibitor of NF-κB）磷酸化,NF-κB被释放出来,进入细胞核内激活靶基因,启动相关细胞因子的基因转录;CpG-ODN也能通过其他信号通路,诱导和粒细胞集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor, G-CSF）,肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-alpha, TNF-α）,白介素6 （Interleukin-6, IL-6）,等细胞因子的高水平转录和表达。如同其他TLR激动剂,CpG-ODN在机体免疫调节治疗,抗病原体等过程中发挥着重要作用,此外CpG-ODN在肿瘤的治疗中也有重要的地位,与肿瘤抗原合用时,能够诱导强烈的CD4⁺和CD8⁺ T细胞应答及快速生成抗原特异性抗体,杀伤肿瘤细胞。但是关于CpG-ODN在辐射损伤治疗方面的研究依然是一片未知领域,值得开展深入探索。已有的文献表明,TLR9激动剂CpG-ODN具有一系列重要的生物活性,从理论上推测这些生物活性对抗辐射损伤应该是十分有益的,其依据是:①TLR9与TLR5有超高的同源性（图示1）,TLR9具有与TLR5相似的信号转导通路能够活化NF-κB[5];②TLR9激动剂CpG-ODN能够刺激免疫细胞分泌G-CSF, TNF-α,IL-6等,这些细胞因子都具有促进造血系统损伤修复,减轻辐射损伤的作用。此外,TLR9激动剂CpG-ODN与TLR5激动剂细菌鞭毛蛋白比较,其毒性更低,获取更容易,文献报道CpG-ODN已被作为免疫调节剂用于临床。将来我们如能证实TLR9激动剂CpG-ODN在减轻辐射损伤中也有极其重要作用,这无疑为辐射损伤治疗药物的研究带来新的方向。本课题围绕TLR9激动剂CpG-ODN辐射损伤治疗作用进行探索,主要研究内容包括:CpG-ODN的设计和制备,并初步评价其对细胞和小鼠的毒性;CpG-ODN对骨髓造血系统辐射损伤的治疗作用;CpG-ODN对小肠组织辐射损伤的治疗作用;CpG-ODN辐射损伤治疗作用机理。最终的结果表明CpG-ODN对辐射损伤具有较好的治疗作用,拥有良好的应用研究前景。实验内容:1. CpG-ODN2395的设计与制备,并初步评价其对细胞和小鼠的毒性（1）参考已有的文献相关报道的CpG-ODN2395序列和修饰方式[6],设计本课题所需CpG-ODN,委托生工生物工程（上海）有限公司进行合成。（2）细胞毒性试验:选用HIEC细胞,分别一次性给予不同剂量CpG-ODN2395（终浓度为0.02、0.04、0.08、0.15、0.30、0.60、1.25、2.50、5.00μM）,孵育48h后MTT法检测其存活率;（3）小鼠急性毒性试验:选用20²2gBALB/c小鼠,分别一次性给予小鼠（n=8只/组）不同剂量CpG-ODN2395（450、900、1350μg/只）,连续观察14d。2. CpG-ODN2395对骨髓造血系统辐射损伤的治疗效应（1）存活率,剂量-存活率线性拟合并计算LD_50/30和DRF:小鼠给予不同剂量电离辐射（6.0Gy,6.5Gy,8Gy,10Gy）剂量率1.0Gy/min后给予不同处理,观察各组小鼠30天存活率,并计算出不同LD_50/30和DRF值(照射给药组LD_50/30与单纯照射组LD_50/30的比值);（2）外周血白细胞和骨髓有核细胞计数:小鼠6Gy照后给予不同处理,在照后1d,9d,28d（分别代表初期、极期、恢复期）取小鼠外周血和骨髓有核细胞,通过CASY细胞计数及分析系统记录细胞数量;（3）骨髓H&E染色:小鼠6Gy照后给予不同处理,在照后1d,9d,28d取小鼠股骨,经过固定、脱钙,最终制作成H&E染色切片;（4）外源性脾集落形成单位测定:参照Till和McCulloch在1961年报道的经典方法;3. CpG-ODN2395对小肠组织辐射损伤的治疗效应（1）小肠H&E染色:小鼠6Gy照射后给予不同处理,在照后5d取小肠,将样本用福尔马林固定,最终制成H&E切片;（2）小肠内TUNEL隐窝细胞原位凋亡:小鼠6Gy照射后给予不同处理,在照后5h取小肠,将样本用中性福尔马林固定,最终制成TUNEL切片;（3）小肠内BrdU隐窝细胞增殖:小鼠6Gy照射后给予不同处理,在照后3d取小肠,取小肠前2h腹腔注射BrdU（2.5mg/只）,将样本用中性福尔马林固定,最终制成BrdU免疫组化切片;（4）微核细胞率:HIEC照后给予不同处理后加入细胞松弛素B （CB）,孵育36h后,细胞固定,DAPI染色,计数微核细胞率（micronucleus cell frequency,MNCF）;4. CpG-ODN2395减轻辐射损伤的作用机理（1）细胞中NF-κB活化:Western法检测细胞中NF-κB抑制因子IκB-α和NF-κB亚基p65的变化,并通过Gene Tools软件对蛋白进行定量分析。（2）血液中氧化应激指标:小鼠6Gy照射后给予不同处理,在照射后2d,4d, 7d取小鼠血浆,检测血浆中的MDA, GSH和SOD的变化;（3）小肠内SOD免疫组化切片:小鼠6Gy照射后给予不同处理,在照后5h取小肠,用中性福尔马林固定,最终制成SOD免疫组化切片;（4）细胞因子含量:小鼠给予CpG-ODN2395后0.5、1、2、4、8、24、48h取小鼠血浆,通过ELASA检测血浆中G-CSF,TNF-α和IL-6的变化。5采用SPSS13.0对实验相关数据进行统计分析。实验结果1. CpG-ODN2395的设计与制备,并初步评价其对细胞和小鼠的毒性（1）本次课题选用的CpG-ODN类型为CpG-ODN2395,共有22个核苷酸序列组成。其序列为:5 -TCGTCGTTTTCGGCGCGCGCCG-3。并对部分碱基进行硫代修饰（黑体加下划线的碱基为硫代修饰,其他碱基为磷酸化修饰）。（2）细胞毒性试验:在HIEC细胞培养液中加入不同浓度的CpG-ODN2395 （0μM⁵.00μM）,通过MTT法检测发现低浓度的CpG-ODN2395对细胞的存活率没有影响,当浓度高达2.5μM时细胞存活率才出现降低,而试验中所用的CpG-ODN2395浓度为0.1μM,远远低于产生细胞毒性的剂量,所以可以认为CpG-ODN2395对细胞是安全的或很少有毒副作用;（3）动物急性毒性试验[17]:小鼠分别给予高剂量CpG-ODN2395 （450、900、1350μg/只）,观察14d未发现小鼠体重减轻和死亡,而试验中给予小鼠的CpG-ODN剂量仅为50μg/只,远远低于急性毒性试验中的剂量,所以可以认为CpG-ODN2395是没有或很少有急性毒性作用。2. CpG-ODN2395对小鼠骨髓造血系统辐射损伤的治疗作用（1）不同剂量照射后小鼠存活率:小鼠分别给予6.0Gy,6.5Gy,8.0Gy和10Gy照射后,单纯照射组存活率分别为95%,58%,35%和0%;照射给药组在存活率为100%,89%,81%和25%。进行剂量-存活率直线拟合计算出单纯照射组LD_50/30为7.6Gy,照射给药组LD_50/30为9.0Gy,DRF值为1.2;（2）外周血白细胞和骨髓有核细胞计数: 6.0Gy照射后1d（初期）,9d（极期）,28d（恢复期）检测外周血白细胞和骨髓中有核细胞数,发现照射给药组外周血白细胞和骨髓有核细胞数在照后1d,9d和28d都比单纯照射组高,特别是在照后9d和28d统计时尤为显著;（3）骨髓H&E染色切片: 6.0Gy照射后,照射给药组与单纯照射组比较,其骨髓损伤较轻,造血功能恢复较快;切片结果与骨髓有核细胞计数结果相吻合;（4）外源性脾集落形成单位测定:通过脾结节数量反映骨髓内多能造血干细胞的含量,实验结果表明照射给药组骨髓细胞在受体小鼠体内形成的脾结节数是单纯照射组的2.1倍;3. CpG-ODN2395对小鼠小肠组织辐射损伤的治疗作用（1）小肠H&E染色:6.0Gy照射后5d,H&E染色观察小肠照后病理学变化,发现照射给药组小肠组织形态比单纯照射组完整;（2）小肠TUNEL隐窝细胞原位凋亡:6.0Gy照射后5h,对TUNEL原位凋亡染色观察和定量发现,照射给药组小肠的隐窝细胞和上皮细胞阳性率比单纯照射组要低;（3）小肠BrdU细胞增殖检测:6.0Gy照射后3d,对BrdU细胞增殖免疫组化切片观察和定量发现照射给药组小肠隐窝细胞阳性率比单纯照射组要高。（4）微核细胞率:计数HIEC细胞在不同剂量辐射后微核细胞形成率,结果显示照射给药组能显著降低微核细胞率;4. CpG-ODN2395辐射损伤防护作用的可能机理（1）细胞中NF-κB活化:NF-κB活化抑制分子IκB-α的含量在照后加入CpG-ODN2395后出现明显降低; NF-κB分子中的一个亚基p65蛋白分子的含量出现明显升高。特别是在照后30min;（2）血液中氧化应激水平变化:在照射后第2d,4d和7d检测血浆中氧化应激指标（MDA,GSH,SOD）,结果显示照射给药组血液系统的氧化应激水平比单纯照射组要低;（3）小肠SOD免疫组化切片:照后5h,对SOD免疫组化染色观察和定量发现,照射给药组小肠组织的SOD含量高于单纯照射组。（4）细胞因子含量变化:发现注射CpG-ODN2395后数小时内能诱导血液中细胞因子G-CSF,TNF-α和IL-6的含量升高。实验讨论辐射损伤治疗一直是生物学与医学面临的难题,世界很多国家已投入巨资开展辐射防护药物的研究,但迄今为止,仅一种辐射防护药物,即WR2721被美国FBA批准进入临床,作为预防性保护措施在放疗中应用,但是其毒副作用较大。因此,在大剂量辐射损伤治疗方面至今尚无特殊治疗良策,主要依靠造血干细胞移植和注射大量造血因子等。近年来免疫学家发现在天然免疫系统里存在着一个重要的组成部分:Toll样受体家族。研究表明TLRs信号通路均可依赖MyD88通路激活NF-?B或是刺激免疫细胞释放某些细胞因子,从而抑制细胞凋亡,促进细胞增殖,清除自由基。2008年Burdelya LG等在Science杂志上首次报道了改良的TLR5激动剂具有极强的辐射防护效应,而且即使是在照后2小时给药仍然具有很强的减轻辐射损伤的效果。提示了TLRs家族激动剂成员在辐射损伤治疗方面有着广泛的研究前景[2]。CpG-ODN是TLR9激动剂,是人工模拟细菌DNA合成的寡聚核苷酸分子,具有细菌DNA活性,能刺激免疫系统活化诱导哺乳动物产生免疫反应的寡核苷酸片段。早在19世纪90年代,人们就发现给癌症患者注射细菌提取物能明显减轻病情,后来发现细菌的DNA成分是主要介导这种抗肿瘤效应的物质,进一步研究结果肯定了细菌DNA具有直接免疫刺激和抗肿瘤作用[18][19]。目前国外已将CpG-ODN用于非霍奇金淋巴瘤[20]、黑色素瘤[21]和脓毒血症[22]等试验研究。根据CpG-ODN的结构和免疫激活作用不同主要将其分为3种类型:A型CpG-ODN,如ODN2216,其结构特征是在ODN的3和5末端有多聚G序列构成,除了两端有少量硫代修饰外,其余主要为磷酸化修饰,可诱导IFN-α从DC（dendritic cell）中释放,从而激活NK细胞和T细胞,但激活B细胞的能力较弱。B型CpG-ODN,如ODN2006,其碱基完全由硫代修饰,是Th1细胞的活化佐剂且有很强的刺激B细胞活化的作用,但刺激pDCs产生IFN-α的作用较弱。C型CpG-ODN,如ODN2395,改型碱基部分由硫代修饰,兼具前两者的免疫活性,并且在体内的稳定性良好[6],所以在本次实验研究中我们首选C型,并且选择有具有典型代表的CpG-ODN2395作为本课题的主要研究对象。我们发现小鼠在照射后给予CpG-ODN2395,存活率明显提高,骨髓造血系统和小肠组织的急性辐射损伤程度减轻,这表明CpG-ODN2395对辐射损伤具有良好治疗作用。虽然其对辐射损伤的治疗作用的机理目前仍不完全清楚,但是,我们发现给予CpG-ODN可以使照后细胞内NF-κB活化抑制分子IκB-α含量表达更加显著降低,NF-κB分子中的亚基之一p65蛋白分子含量对应的更加升高;微核细胞数相应降低;通过对MDA、GSH和SOD等氧化应激指标的观察,发现照射给药组动物血液系统和小肠组织中的氧化应激水平比单纯照射组要低;血液中G-CSF,TNF-α和IL-6细胞因子的含量在注射CpG-ODN2395后数小时显著升高。这些实验结果表明CpG-ODN2395减轻辐射损伤的机制可能是激活NF-κB,提高机体抗氧化损伤能力和促进G-CSF,TNF-α和IL-6与造血和免疫功能相关细胞因子的分泌。另外,文献报道CpG-ODN已被作为免疫调节剂用于临床,本研究对CpG-ODN2395初步毒性分析显示无明显的急性毒性,提示该TLR9激动剂CpG-ODN将来在辐射损伤临床治疗应用方面可能有很好的发展前景。