论文部分内容阅读
目前,肿瘤仍然是威胁人类健康最为严重的疾病之一,传统肿瘤治疗方法包括肿瘤切除、化学疗法与放射疗法等,但是这些传统治疗方式具有一定的局限性,治疗效果并不理想。光热疗法(photothermal therapy,PTT)作为一种新型的肿瘤治疗技术,主要是利用较高光热转换材料所产生的高热量来杀死肿瘤细胞,由于其具有微创、高效、不良反应低且能抑制肿瘤转移等特点,已经在肿瘤治疗方面引起了高度关注。但是在肿瘤光热治疗中普遍存在热耐受现象,是影响光热治疗的一个关键因素。导致肿瘤热耐受的原因多种多样,热休克蛋白(HSPs)是其中一个主要因素。HSPs可以提高细胞的应激能力,特别是耐热能力,并能够与多种肿瘤抗原形成复合物,可增强其对外界刺激的抵御能力,从而产生耐受性,使光热治疗的效果降低,导致治疗失败。因此,想要克服光热治疗中的热耐受问题,就要从根本上降低HSPs。HSPs的合成需要消耗大量的ATP,ATP的获得主要来源于糖有氧氧化途径中的三羧酸循环,因此,本文设想通过阻断HSPs的ATP供应来克服光热治疗中的热耐受问题。由于金属有机框架类沸石咪唑酯骨架ZIF-8(MOF)能够可控释放出Zn2+,并且Zn2+可以抑制三羧酸循环中的细胞色素C氧化酶,阻断三羧酸循环,限制ATP的产生,从而降低HSPs,抑制热耐受,逆转肿瘤,增加热疗效果。本课题首先通过溶剂法制备了载体MOF,合成了黑色素纳米粒(MNP),然后将MNP成功包裹于载体MOF中,构建出黑色素纳米递送系统(MNP@MOF)。在肿瘤细胞溶酶体内,载体MOF会被瓦解释放出内部所包裹的黑色素纳米粒MNP和Zn2+。本文以鼠源乳腺癌细胞4T1为细胞模型,考察了黑色素纳米递送系统的体外抗肿瘤活性,以雌性BALB/c小鼠为实验动物,考察了纳米制剂MNP@MOF的体内成像及体内药效学。具体内容如下:第一部分:黑色素纳米递送系统的制备与表征。本文首先合成载体MOF和黑色素纳米粒MNP,然后将MNP包裹于MOF载体中构建MNP@MOF,通过紫外分光光度计检测到MNP在582 nm处存在最大吸收峰,采用激光纳米粒度分析仪测得MOF、MNP和MNP@MOF的平均粒径分别为60±6.8 nm、5.4±1.2nm、67.6±5.4 nm左右,其平均电位分别为10.12±0.48 mV、-22.3±0.8 mV、-9.8±2.1 mV左右;透射电镜结果与粒径仪测定结果一致。在4℃条件下,放置一个月后,纳米粒的粒径电位、包封率和载药率均无明显变化,说明稳定性良好;采用超滤离心法与紫外可见分光光度法测得该纳米粒包封率为92%、载药率为10%;光热转换性能实验表明制剂MNP@MOF在808 nm激光发射器作用下,3 min内温度迅速升至42℃以上,可知光热转化效率高。体外释放结果显示MNP@MOF中MNP在pH 5.0条件下释放率达到70%以上,而在pH 7.4条件下释放率仅为10%左右。在pH 5.0条件下MNP@MOF中释放出Zn2+的浓度为1.4 mg/L,而在pH 7.4条件下释放出Zn2+的浓度为0.055 mg/L,因此可知在pH 5.0条件下MNP的释放与Zn2+的释放远高于pH 7.4条件下的释放。第二部分:黑色素纳米递送系统的体外抗肿瘤活性研究本文以4T1鼠源乳腺癌细胞为细胞模型,通过MTT法考察了空白载体MOF的生物相容性以及该黑色素纳米递送系统对4T1细胞存活率的影响;从细胞摄取结果可知,4T1细胞对最终制剂的摄取能力明显高于游离的FITC,说明纳米制剂有助于细胞摄取;通过ATP试剂盒检测在4T1细胞中各种制剂处理细胞后ATP水平表达的情况;采用Western blot实验考察各种制剂对4T1细胞中HSP70/90表达所产生的影响,用来评价纳米递送系统的光热耐受逆转能力;通过热成像仪考察各种制剂在处理4T1细胞后的光热效果;采用AM/PI试剂盒考察制剂对细胞内活死细胞数量的影响;通过流式细胞仪分析各制剂组对细胞凋亡的影响。实验结果如下:MTT实验结果显示,MNP@MOF制剂组在808 nm激光照射条件下,相比其他制剂组,对肿瘤细胞活性抑制效果最强;摄取实验结果表明,4T1细胞可以摄取更多的MNP@MOF,从而提高了细胞内制剂浓度;ATP检测水平结果显示,空白载体MOF组与MNP@MOF+NIR制剂组能够明显降低ATP的水平,说明载体MOF能够阻断肿瘤细胞内ATP的产生;Western blot实验结果可知,MNP@MOF+NIR制剂组对HSP70/90蛋白的表达具有明显地抑制作用,证实了纳米制剂可以下调HSP70/90蛋白;光热效率考察实验结果表明,MNP@MOF制剂组在808 nm激光照射条件下,3 min内温度能够迅速升到42℃以上,能够成功地将光能转化为热能;通过活死细胞实验分析,相比其他制剂组,MNP@MOF制剂组在808 nm激光照射条件下,死细胞数量最多,肿瘤抑制效果最强;细胞凋亡实验表明,MNP@MOF制剂组在808 nm激光照射条件下能够诱导更多细胞凋亡。上述实验结果表明,纳米制剂MNP@MOF具有明显地抑制逆转肿瘤光热耐受。第三部分:黑色素纳米递送系统的体内成像及体内药效学研究。我们选用雌性BALB/c小鼠为实验动物,以鼠源乳腺癌细胞4T1来建立动物模型,考察了纳米制剂MNP@MOF的体内成像及体内药效学。通过对小鼠给药前后的体重、肿瘤体积变化、HE染色及TUNEL实验来研究纳米体系的体内药效学。从实验结果显示MNP@MOF+NIR组的抗肿瘤活性最强,说明MNP@MOF+NIR组能够抑制热耐受,增强抗肿瘤效果。HE染色病理切片结果表明MNP@MOF+NIR组对小鼠各组织器官均无明显毒副作用,说明最终制剂能够高效地在肿瘤内部实现释放,降低了制剂的毒副作用。通过小鼠活体成像实验考察了 MNP@MOF在小鼠体内的分布情况,从活体成像结果表明,MNP@MOF在肿瘤部位处的荧光信号强度明显高于其他组织,说明该纳米系统具有良好的抗肿瘤作用。基于以上研究结果可知,本课题所研究的纳米递送系统生物安全性较好,为解决肿瘤光热耐受奠定良好的基础。