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树枝状大分子(Dendrimer)是一类新型的功能高分子化合物,它的特点是可以在分子水平进行分子的大小、形状和功能基团的设计。把树枝状大分子引到硅胶表面,可以大大增加硅胶的表面积、容量和选择性。固定化酶具有稳定性好、可重复并连续使用等优点,克服了游离酶对环境敏感、性质不稳定、易失活或死亡等缺点。聚酰胺-胺(PAMAM)作为一种性能优良的树枝状大分子,可作为酶的固定化载体,利用其自身的特点,提高单位面积内固定化酶量。
本文采用发散合成法,使用直径50μm的硅胶,经过氢氧化钠、去离子水、盐酸处理后,以3-氨丙基-三乙氧基硅烷(APTES)作为硅烷化试剂,通过丙烯酸甲酯与APTES的端氨基发生Micheal加成反应,得到0.5G的聚酰胺-胺(PAMAM),之后端酯基与乙二胺发生酰胺化反应,得到1.0G的枝形大分子PAMAM表面修饰的硅胶,重复以上过程,制得2.0G、3.0G树枝状大分子表面修饰的硅胶。采用氨基滴定、核磁共振、扫描电镜、荧光显微镜和元素分析等手段对合成产物的结构和性能进行了表征,结果表明合成的树枝状大分子具有良好的性能。
使用戊二醛交联氨基酰化酶与PAMAM,在戊二醛浓度为1%、交联时间4h、交联温度25℃的条件下固定氨基酰化酶,固定后的氨基酰化酶拥有较高的活性;以1.0G-3.0G树枝分子PAMAM分别与氨基酰化酶进行交联,发现固定化酶的活性呈逐代递增趋势。研究了pH、Co2+浓度和底物浓度对固定化酶活性的影响,结果表明,固定化氨基酰化酶的最佳反应条件为pH7.5,温度65℃。比较了游离酶和固定化酶的热稳定性和储存稳定性,结果表明,固定化酶的热稳定性和储存稳定性远远好于游离酶。固定化酶的半衰期为34d。
采用固定后的氨基酰化酶与N-乙酰-DL-蛋氨酸反应,用毛细管区带电泳(CZE)对酶解后的酶解液进行了研究。结果显示该固定化氨基酰化酶具有良好的效率、重现性和稳定性。