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背景:长期饮酒会导致肝脏脂肪变性,持续过量饮酒会发展为炎症、纤维化,最终导致肝硬化。酒精性肝损伤的发病机制是多因素的,除了遗传因素外,酒精能够导致肝细胞损伤、氧自由基过度蓄积、细菌微生物过度生长以至于肝脏脂肪变性和炎症细胞(巨噬细胞和中性粒细胞)的激活。持续的促炎细胞因子浸润则会活化星状细胞,导致肝脏纤维化。除戒酒外,临床上常用保肝药物对酒精性肝损伤病人进行维持治疗。因此对于酒精性肝损伤的药物研究、开发,是十分必要的。在中医理论中,以陈皮进行单味药进行“酒病”的论治由来以久。此外在高频药物聚类分析技术的帮助下,发现陈皮在429首解酒方中的频次仅次于甘草,位于第二位次。橙皮素是源于芸香科柑橘属植物果实的一类天然黄酮类化合物,是陈皮的主要活性成分。在本实验室的前期研究中,发现编号为HD-1L的橙皮素衍生物(4-三氟甲基溴苄橙皮素)的药理活性较强且毒副作用小。目的:本研究拟通过小鼠酒精性肝损伤模型和体外细胞模型探究橙皮素衍生物HD-1L的抗炎活性及分子机制。材料及施在本研究中进行了以下的几部分实验:1)在本次实验中,首先探究橙皮素衍生物HD-1L在小鼠模型中的药效,采用高斌模型法构建小鼠酒精性肝损伤模型,采用口服灌胃方式对小鼠进行给药处理。分组如下:正常组、模型组(酒精喂食)、模型+低剂量HD-1L组(25 mg/kg)、模型+中剂量HD-1L组(50 mg/kg)、模型+高剂量HD-1L组(100 mg/kg)、正常+高剂量HD-1L组(100 mg/kg)、正常+地塞米松组(1 mg/kg)。通过病理学(HE染色)、血清学(ALT、AST含量测定)、肝质量/体质量比值、蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量PCR及ELISA方法检测小鼠在酒精性肝损伤模型完成后的肝脏损伤情况及促炎因子的表达水平。2)在体外实验中,以RAW 264.7细胞进行体外炎症研究,通过对细胞进行酒精处理获得体外炎症模型,并进行机制的研究。在探究HD-1L的药效实验中进行如下分组:1.正常对照组;2.模型组(100 mM酒精);3.模型+HD-1L(5 μ g/ml);4.模型+HD-1L(10 μ g/ml);5.模型+HD-1L(20 μ g/ml);6.正常+HD 1L(20 μ g/ml)。通过蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量PCR实验及ELISA法探究促炎因子的表达水平。3)采用Discover Studio软件进行分子模拟配对实验、并采用TR-FRET实验及ELISA实验进行验证HD-1L与Brd2的关系。4)在小鼠体内模型中探究Brd2在酒精性肝炎中的作用,设立如下分组:1.正常对照组;2.模型(酒精喂食)组;3.模型+JQ1(50 mg/kg,Brd2抑制剂)组。通过病理学(HE染色)、血清学(谷丙转氨酶、谷草转氨酶含量测定)、肝质量/体质量比值、蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量PCR及ELISA方法检测小鼠在酒精性肝损伤模型完成后的肝脏损伤情况及促炎因子的表达水平。5)探究Brd2在HD-1L的药效活性中的作用,采用RAW 264.7细胞,并设计了四个分组:1.正常对照组;2.模型组(100 mM酒精);3.模型+HD-1L;4.模型+HD-1L+Brd2过表达。采用蛋白质免疫印迹法、实时荧光定量PCR法及ELISA法进行研究。6)在探究HD-1L的信号通路的研究中,分别采用药理学及生物技术的方法对RAW 264.7细胞的Brd2表达进行干扰处理,有如下两部分独立实验,第一部分分组如下:1.正常对照组;2.模型组(100 mM酒精刺激);3.模型+空载体组;4.模型+si-Brd2(基因沉默)组。第二部分分组如下:1.正常对照组;2.模型组(100 mM酒精刺激);3.模型+JQ1药物(250 nM)。采用蛋白质免疫印迹法探究NF-κB通路关键蛋白的表达水平。结果:1)HD-1L对于酒精性肝损伤具有保护作用:HE染色、谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定及小鼠的肝/体质量比值提示HD-1L能显著抑制酒精造成的小鼠肝脏损伤及水肿,同时ELISA、蛋白质免疫印迹实验及荧光实时定量PCR实验指出HD-1L能显著抑制酒精导致的TNF-α、IL-1β及IL-6的高表达;2)HD-1L能显著抑制酒精导致的RAW 264.7细胞的炎症反应:ELISA、蛋白质免疫印迹实验及荧光实时定量PCR实验指出HD-1L能显著抑制酒精导致的TNF-α、IL-1β及IL-6 的高表达;3)HD-1L可能通过Brd2作用于酒精性肝炎:模拟分子配对实验、TR-FRET实验及ELISA实验均提示HD-1L能与Brd2结合且高度负相关;4)抑制Brd2蛋白水平可以显著保护肝脏不受酒精导致的损伤:HE染色、谷丙转氨酶、谷草转氨酶测定实验提示HD-1L能显著抑制酒精造成的小鼠肝脏损伤,同时ELISA、蛋白质免疫印迹实验及荧光实时定量PCR实验指出HD-1L能显著抑制酒精导致的TNF-α、IL-1β及IL-6的高表达;5)HD-1L通过抑制Brd2蛋白来发挥抗炎作用:实时荧光定量PCR及ELISA实验结果指出,当Brd2过表达时,HD-1L的抗炎活性消失。6)Brd2蛋白影响NF-κB炎症信号通路:蛋白质免疫印迹实验指出Brd2抑制剂(JQ1)及Si-Brd2(基因沉默)可以显著抑制p-P65蛋白的表达。结论:HD-1L通过抑制Brd2蛋白水平来抑制NF-κB炎症信号通路的活化,最终抑制酒精导致的肝脏炎症反应,发挥肝脏保护作用。