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研究背景：
视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa,RP）是一种进行性眼部遗传病，其主要特征是色素上皮以及光感受器功能逐渐退化，目前尚未出现有效的治疗方法。这一病变的遗传形式主要有三种：常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传以及X连锁遗传。其中，X连锁遗传（X-linked retinitis pigmentosa,XLRP）虽发病率低，但症状最严重，易致盲。现已知在XLRP中最常见的突变基因为RPGR（retinitis pigmentosa GTPase regulator）基因，近70%的XLRP由该基因异常所致。
CRISPR/Cas系统（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat（CRISPR）/Cas-based RNA-guided DNA endonuclease system），即规律并成簇的有间隔的短回文重复序列以及其相关蛋白核酸内切酶系统，是目前较为热门的基因编辑工具。这一编辑系统是在单链引导RNA（single guide RNA,sgRNA）作用下，募集Cas9蛋白在特定位点发挥作用，从而使目的位点的DNA序列发生双链断裂（DNA double-strand breaks,DSB）。基因序列断裂后常见的修复方式有两种：非同源性末端接合（Non-homologous end joining,NHEJ）以及同源介导修复（Homology directed repair,HDR）。相比于NHEJ会随机产生插入缺失（Insertion or deletions,Indels），HDR的特异性更强，更利于基因修复。
目前已报道的CRISPR/Cas系统的编辑基因，大部分为研究者们经过多次实验后挑选出来的。这些位点的编辑效率相对较高，但大多并未囊括临床上现已知的致病突变，而了解该系统用于临床致病基因的编辑情况对于基因治疗而言尤为重要，特别是那些高GC含量并且高重复的序列，更需要基础实验数据为临床应用作铺垫。因此本实验选取了视网膜色素变性中较有代表性的RPGR ORF15基因进行基因编辑，以评估CRISPR/Cas系统应用于RP治疗的可能。
研究目的：
1.构建能够稳定表达且含有视网膜色素变性致病基因突变的细胞系；
2.优化HDR条件，提高RPGR ORF15突变同源重组效率；
3.为CRISPR/Cas系统应用于RP治疗奠定基础。
研究方法：
1.构建含有RPGR ORF15突变与EGFP融合表达的载体，通过慢病毒包装进一步感染HEK-293细胞系，并使用EGFP、嘌呤霉素报告系统筛选出能够稳定表达致病突变的单克隆细胞团块，并进行扩大培养；
2.设计靶向RPGR ORF15的sgRNA,通过流式和高通量测序测试不同位点的切割效率；
3.在最佳作用位点切割的情况下，测试不同供体DNA的长度、靶向性以及其作用时间、浓度对同源重组效率的影响，进一步比较同源修复与先导编辑器（Primer Editors,PE）效率是否有差异；
4.对表达RPGR ORF15突变的细胞系进行修复，利用高通量测序对其治疗视网膜色素变性的能力进行分析。
研究结果：
1.成功构建RPGR ORF15致病突变与EGFP融合表达的细胞系；
2.发现供体DNA长度以及剂量的变化对HDR效率影响较小，sgRNA的切割位点离突变位点愈近修复效率愈高，且对供体DNA的选择具有偏向性；
3.随着细胞内作用时间的延长，修复效率稍有增高，在第5天时达到高峰；
4.对于高GC含量且高重复的序列，HDR的修复效率为PE2的30倍。
研究结论：
1.视网膜色素变性突变能被同源修复，对于高GC含量且高重复的序列HDR的效率相比于PE2修复效率明显增高；
2.通过选择合适切割位点、调整供体DNA长度以及剂量、摸索不同修复时间等优化，可使HDR修复效率有所提升；
3.CRISPR/Cas9系统介导的HDR尽管对于临床应用而言，修复效率仍有待提高，但其有巨大的提升空间，在用于视网膜色素变性等眼科疾病的基因治疗上具有巨大的潜力。
视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa,RP）是一种进行性眼部遗传病，其主要特征是色素上皮以及光感受器功能逐渐退化，目前尚未出现有效的治疗方法。这一病变的遗传形式主要有三种：常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传以及X连锁遗传。其中，X连锁遗传（X-linked retinitis pigmentosa,XLRP）虽发病率低，但症状最严重，易致盲。现已知在XLRP中最常见的突变基因为RPGR（retinitis pigmentosa GTPase regulator）基因，近70%的XLRP由该基因异常所致。
CRISPR/Cas系统（clustered regulatory interspaced short palindromic repeat（CRISPR）/Cas-based RNA-guided DNA endonuclease system），即规律并成簇的有间隔的短回文重复序列以及其相关蛋白核酸内切酶系统，是目前较为热门的基因编辑工具。这一编辑系统是在单链引导RNA（single guide RNA,sgRNA）作用下，募集Cas9蛋白在特定位点发挥作用，从而使目的位点的DNA序列发生双链断裂（DNA double-strand breaks,DSB）。基因序列断裂后常见的修复方式有两种：非同源性末端接合（Non-homologous end joining,NHEJ）以及同源介导修复（Homology directed repair,HDR）。相比于NHEJ会随机产生插入缺失（Insertion or deletions,Indels），HDR的特异性更强，更利于基因修复。
目前已报道的CRISPR/Cas系统的编辑基因，大部分为研究者们经过多次实验后挑选出来的。这些位点的编辑效率相对较高，但大多并未囊括临床上现已知的致病突变，而了解该系统用于临床致病基因的编辑情况对于基因治疗而言尤为重要，特别是那些高GC含量并且高重复的序列，更需要基础实验数据为临床应用作铺垫。因此本实验选取了视网膜色素变性中较有代表性的RPGR ORF15基因进行基因编辑，以评估CRISPR/Cas系统应用于RP治疗的可能。
研究目的：
1.构建能够稳定表达且含有视网膜色素变性致病基因突变的细胞系；
2.优化HDR条件，提高RPGR ORF15突变同源重组效率；
3.为CRISPR/Cas系统应用于RP治疗奠定基础。
研究方法：
1.构建含有RPGR ORF15突变与EGFP融合表达的载体，通过慢病毒包装进一步感染HEK-293细胞系，并使用EGFP、嘌呤霉素报告系统筛选出能够稳定表达致病突变的单克隆细胞团块，并进行扩大培养；
2.设计靶向RPGR ORF15的sgRNA,通过流式和高通量测序测试不同位点的切割效率；
3.在最佳作用位点切割的情况下，测试不同供体DNA的长度、靶向性以及其作用时间、浓度对同源重组效率的影响，进一步比较同源修复与先导编辑器（Primer Editors,PE）效率是否有差异；
4.对表达RPGR ORF15突变的细胞系进行修复，利用高通量测序对其治疗视网膜色素变性的能力进行分析。
研究结果：
1.成功构建RPGR ORF15致病突变与EGFP融合表达的细胞系；
2.发现供体DNA长度以及剂量的变化对HDR效率影响较小，sgRNA的切割位点离突变位点愈近修复效率愈高，且对供体DNA的选择具有偏向性；
3.随着细胞内作用时间的延长，修复效率稍有增高，在第5天时达到高峰；
4.对于高GC含量且高重复的序列，HDR的修复效率为PE2的30倍。
研究结论：
1.视网膜色素变性突变能被同源修复，对于高GC含量且高重复的序列HDR的效率相比于PE2修复效率明显增高；
2.通过选择合适切割位点、调整供体DNA长度以及剂量、摸索不同修复时间等优化，可使HDR修复效率有所提升；
3.CRISPR/Cas9系统介导的HDR尽管对于临床应用而言，修复效率仍有待提高，但其有巨大的提升空间，在用于视网膜色素变性等眼科疾病的基因治疗上具有巨大的潜力。