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研究背景:变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是鼻黏膜的一种炎症反应性疾病,主要是机体暴露于变应原后,由IgE介导的Th2免疫应答。变应性鼻炎的主要临床症状是鼻腔发痒、频繁连续数个喷嚏、清水样涕、鼻塞。局部变应性鼻炎(local allergic rhinitis,LAR)是指具有非特异性体质的患者暴露于变应原后,鼻黏膜出现肥大细胞活化和嗜酸性粒细胞浸润的I型变态反应,同时也出现类似变应性鼻炎的典型症状。与经典的AR不同的是变应原皮肤点刺试验(skin prick test,SPT)和血清变应原特异性IgE(specific IgE,sIgE)检查均未能找到明确的过敏原。SPT和外周血sIgE检测主要反映了机体全身的特异质状态,并不能准确反应鼻腔这个靶器官的局部过敏状态。在对LAR患者进行鼻腔变应原激发试验时,可诱发典型的AR症状,提示LAR的发病机制可能不同于经典的AR,可能存在非IgE介导的炎症机制参与了LAR的发病。AR经典的发病机制是Th1/Th2细胞失衡理论,Th2细胞因子表达占优势表达,Th1细胞因子受到抑制。IL-4是Th2细胞分泌的主要细胞因子,IgE的产生依赖于IL-4,而LAR患者血清中未能检测出sIgE,这表明Th2细胞免疫应答在LAR不占主导作用。目前所知Th17细胞与Th1细胞有交互调节作用,而且Th17细胞分泌的细胞因子IL-17A与AR的症状正相关,IL-17A可能参与了LAR的发病。肥大细胞和嗜酸性粒细胞分别为鼻部变态反应的初级和次级效应细胞,肥大细胞激活后可释放炎性介质类胰蛋白酶(Tryptase),与蛋白酶激活受体2(proteinase-activated receptors 2,PAR2)结合后使肥大细胞活化得到正反馈调节。肥大细胞产生细胞因子、化学趋化因子,选择性地募集嗜酸性粒细胞迁移,并在鼻黏膜浸润,活化后释放嗜酸性粒细胞阳离子蛋白(eosinophil cationic protein,ECP),对鼻黏膜进行毒性损害。本研究以PAR2为切入点,通过屋尘螨变应原蛋白通过激活PAR2后Th1/Th2/Th17细胞因子的变化,来阐明LAR可能的发病机制。第一部分LAR小鼠模型的建立目的:通过屋尘螨变应原蛋白鼻腔致敏方式构建并评估LAR小鼠模型。研究方法:将实验小鼠分为4组,鼻腔致敏组、鼻腔致敏对照组、腹腔致敏组、腹腔致敏对照组。鼻腔致敏组采用屋尘螨(house dust mite,HDM)变应原蛋白鼻腔滴药致敏,致敏期为14天的方式建立LAR小鼠模型,PBS为空白对照。腹腔致敏组以屋尘螨变应原腹腔注射致敏建立的传统的AR小鼠模型作阳性对照。采用HE染色和甲苯胺蓝染色分别观察各组小鼠鼻黏膜嗜酸性粒细胞和肥大细胞浸润情况,以及鼻黏膜的病理学改变,通过酶联免疫吸附试验鼻腔灌洗液组胺的测定及血清屋尘螨sIgE的测定,结合行为症状学评分判断LAR动物模型是否成功。结果:HDM激发后,鼻腔致敏组和腹腔致敏组小鼠均出现了明显的喷嚏、挠鼻及流涕的表现,总计分>5分,同各组对照组相比有统计学意义。鼻腔致敏组小鼠和腹腔致敏组小鼠的鼻黏膜可见明显的炎症反应,有不同程度的嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润,黏膜下血管扩张,腺体增生;甲苯胺蓝染色可见多少不等的肥大细胞,对照组的鼻黏膜无以上表现。鼻腔致敏组和腹腔致敏组小鼠鼻腔灌洗液中组胺的浓度明显高于对照组;腹腔致敏组血清总IgE及HDM sIgE较对照组均升高,而鼻腔致敏组总IgE及HDM sIgE较对照组无明显变化。结论:鼻腔致敏组小鼠出现了传统腹腔致敏构建的AR模型症状,鼻腔激发后鼻腔灌洗液中组胺升高,而血清HDM sIgE阴性,鼻黏膜呈现变应性炎症反应,成功的模拟了LAR的特征性改变。第二部分HDM诱发小鼠在不同致敏时程中免疫反应特征的研究目的:延长LAR小鼠动物模型的致敏时程,比较在不同致敏时程变应原暴露模式下,血清sIgE水平与屋尘螨暴露时间的关系,探讨Th1/Th2/Th17细胞因子表达水平的变化及意义,明确LAR是否存在着非IgE介导的炎症反应。研究方法:采取不同的致敏时程建立小鼠不同表型的AR模型:致敏期14天为鼻腔短时程致敏组,致敏期28天为鼻腔长时程致敏组,并用PBS作为各组的空白对照。通过流式细胞因子微球检测技术(cytometric bead arry,CBA)测鼻黏膜组织中Th1/Th2/Th17细胞因子的变化,通过酶联免疫吸附试验检测血清总IgE、sIgE和鼻腔灌洗液中组胺的变化,比较不同致敏时程变应原暴露模式下以上指标的变化。结果:鼻腔短时程致敏小鼠和长时程致敏小鼠的在末次鼻腔激发后,喷嚏、挠鼻及流涕症状总计分均大于5分,鼻腔黏膜都出现了不同程度的变应性炎症反应。短时程致敏组小鼠血清总IgE及HDM sIgE和对照组比较无变化,随着致敏时程的延长,小鼠血清总IgE及HDM sIgE升高,LAR演变成AR。短时程致敏小鼠鼻黏膜组织中Th17细胞因子(IL-17A)明显升高、Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2)明显降低、而Th2细胞因子(IL-4、IL-10)无明显变化,随着致敏时的延长,Th17细胞因子(IL-17A)又逐渐下降,Th2细胞因子(IL-4、IL-10)逐渐上升,Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2)较前无明显变化。结论:随着鼻腔变应原暴露时间的延长,LAR模型逐渐演变为AR模型。Th1/Th2/Th17细胞因子均参与了变应性炎症反应;在LAR的发病中,Th1/Th17反应调控占主导作用,IL-17A的产生间接抑制了sIgE的生成。第三部分PAR2在HDM变应原诱发小鼠LAR中的作用研究目的:探讨PAR2在HDM变应原诱导小鼠LAR中的作用研究。研究方法:将实验小鼠分为4组:LAR组、激动剂组、抑制剂组、正常对照组,采取屋尘螨变应原鼻腔致敏。免疫组化检测鼻黏膜PAR2在四组的表达,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应检测小鼠鼻黏膜中PAR2、Tryptase及ECP的mRNA,流式CBA技术检测小鼠血清Th1/Th2/Th17细胞主要细胞因子的变化。结果:免疫组化显示PAR2呈现棕黄色颗粒黏膜下组织细胞胞浆中,激动剂使其表达增多,抑制剂使其不表达。激动剂可进一步加重小鼠鼻黏膜的损害,出现黏膜上皮层剥脱,结构的紊乱;抑制剂通过抑制PAR2活化后,阻止了鼻黏膜的变应性炎症反应。PAR2激动剂使鼻黏膜组织中Tryptase mRNA及ECP mRNA的表达增高,抑制剂刚好相反。PAR2激动剂诱导LAR小鼠血清IL-17A、IL-10进一步升高,IFN-γ进一步降低,对IL-4的作用不明显。抑制剂减轻了IL-17A、IL-10的升高和IFN-r的降低。结论:在LAR的发病中,屋尘螨变应原蛋白引起鼻黏膜的免疫炎症反应部分依赖于PAR2的激活,阻断鼻黏膜PAR2的激活,可阻止变应性炎症的发展,揭示PAR2可作为LAR治疗潜在的药物靶点。