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目的:探索热休克蛋白90（Heat Shock Protein 90,HSP90）在类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）骨破坏中的作用,并以HSP90为切入点探索火把花根片及其重要活性成分雷公藤甲素抗RA骨破坏的机制。方法:（1）采用核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL）诱导的骨髓巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages,BMMs）向破骨细胞分化模型,诱导3 d和5 d时,进行TRAP染色和F-actin染色观察破骨细胞形成和分化情况。采用q PCR、免疫荧光和Western Blot方法检测破骨细胞中HSP90的表达,同时检测破骨细胞分化调控蛋白肿瘤坏死因子受体相关分子（TNF receptor associated factor 6,TRAF6）、活化T细胞核因c1（Nuclear factor of activated T cells 1,NFATc1）和破骨分化标志蛋白基质金属蛋白酶-9（Matrix metallopeptidase 9,MMP9）、组织蛋白酶K（Cathepsin K,CTSK）表达。质粒转染过表达HSP90后观察破骨细胞形成与分化情况,Western Blot破骨细胞分化相关蛋白的表达情况,免疫荧光法检测NFATc1蛋白入核表达情况。体内建立牛Ⅱ型胶原乳剂诱导的大鼠胶原诱导型关节炎（Collagen induced arthritis,CIA）模型,苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,HE）染色和TRAP染色观察关节骨破坏情况;免疫组化观察大鼠关节滑膜组织、软骨组织、骨小梁处HSP90蛋白表达情况;Western Blot检测关节骨组织中HSP90蛋白以及破骨细胞调控蛋白（NFATc1、TRAF6）和破骨形成标志蛋白（CTSK、MMP9）的表达。（2）建立RANKL诱导的破骨细胞分化模型,给予不同浓度火把花根片（10μg/m L、20μg/m L、40μg/m L）干预,TPAR染色和F-actin染色观察破骨细胞形成和分化情况,免疫荧光染色检测HSP90蛋白表达情况。正常SD大鼠灌胃给予火把花根片后,收取血浆样本。进一步采用Q-TOF-MS技术对火把花根片成分及入血成分进行分析。（3）建立RANKL诱导破骨细胞分化模型给予不同浓度（4 n M、8 n M）雷公藤甲素和（6 n M、12 n M）雷公藤红素干预,通过TRAP染色比较二者药效。选择药效更佳的雷公藤甲素进行下一步机制探索,采用TRAP染色和F-actin染色明确雷公藤甲素对破骨细胞形成、分化的影响,免疫荧光染色观察破骨细胞HSP90蛋白表达情况,Western Blot实验分别检测HSP90、TRAF6、NFATc1和破骨形成标志性蛋白MMP9、CTSK的表达情况,免疫荧光法检测NFATc1蛋白入核表达情况。体内建立CIA大鼠模型,二次免疫后给药组给予雷公藤甲素（3.75、15μg/kg）,模型组和空白组给予0.3%CMC-Na溶液,每隔3 d观察并记录大鼠关节炎临床积分和发病率,HE染色和TRAP染色观察大鼠关节组织骨破坏情况,Western Bot实验检测大鼠关节组织HSP90、TRAF6、NFATc1,破骨细胞形成标志性蛋白MMP9、CTSK的表达情况。结果:（1）HSP90可以促进RA破骨细胞形成与分化:体外实验结果表明,在成功建立的体外RANKL诱导的破骨细胞分化模型中,诱导5 d较诱导3 d破骨细胞数目更多,分化更为成熟。诱导状态下,TRAF6/NFATc1信号通路激活,HSP90m RNA的表达和HSP90蛋白表达均显著升高。当采用质粒转染过表达HSP90后,破骨细胞分化调控蛋白NFATc1和破骨形成标志性蛋白MMP9、CTSK蛋白表达增强且NFATc1蛋白入核表达增强。体内结果表明,CIA模型大鼠关节组织发生骨破坏,关节组织中破骨细胞调控蛋白TRAF6、NFATc1,破骨细胞形成标志性蛋白MMP9、CTSK的表达均上调,且与HSP90在CIA模型大鼠关节组织中的高表达呈正相关。免疫组化实验也证实了同样结果,HSP90在CIA大鼠滑膜组织、骨小梁和软骨组织处均呈现高表达。（2）火把花根片干预RA骨破坏的初步机制和物质基础:基于RANKL诱导体外破骨细胞分化模型,TRAP染色和F-actin染色显示,火把花根浸膏干预后,破骨细胞分化受到明显的抑制,免疫荧光实验表明这可能与其下调HSP90在破骨细胞中的表达有关。火把花根片体外成分和入血成分实验结果表明,6种化学成分以原型的形式进入大鼠血浆中,分别为雷藤内酯三醇、雷公藤春碱、雷藤二萜酸、雷酚内酯、雷公藤甲素、雷公藤红素,提示这6个成分很可能是火把花根片发挥抗RA骨破坏作用的重要活性成分。其中雷公藤甲素和雷公藤红素是目前研究较多且药效明确的抗RA成分,TRAP染色结果显示,雷公藤甲素对破骨细胞形成的抑制作用优于雷公藤红素,雷公藤甲素具有微量高效的优点。因而选择雷公藤甲素进行进一步的机制探索。（3）雷公藤甲素通过调控HSP90抑制RA骨破坏:TRAP染色和F-actin染色结果表明雷公藤甲素可以抑制破骨细胞的形成与分化,Western Blot实验表明雷公藤甲素可以通过下调HSP90蛋白表达进而抑制TRAF6/NFATc1信号通路的激活。体内成功建立CIA大鼠模型,雷公藤甲素可以有效抑制CIA大鼠关节肿胀程度和发病率,并且Western Blot结果显示较模型组相比,雷公藤甲素可显著下调HSP90蛋白表达,并且抑制TRAF6/NFATc1信号通路的激活。结论:（1）HSP90是RA骨破坏发生和发展的重要靶点,且HSP90发挥作用可能依赖于TPAF6/NFATc1信号通路。（2）火把花根片能够下调HSP90从而抑制破骨细胞形成与分化,雷公藤甲素、雷公藤红素是火把花根片抗RA骨破坏的重要活性成分,其中雷公藤甲素效价更佳。（3）雷公藤甲素能够下调HSP90从而抑制TRAF6/NFATc1信号通路减轻RA骨破坏。