脓毒症(Sepsis)是由严重感染或创伤诱发机体炎症调控机制失控所导致的临床综合征,是重症感染患者和动物死亡的主要原因之一。近年来的研究发现,脓毒症免疫抑制时期患者死亡人数常常超过脓毒症急性炎症阶段患者死亡数。而与免疫抑制相关的免疫病理学改变则被认为是导致大多数从最初的过度炎症中存活下来的病患在后期死亡的主要原因。本研究通过注射内毒素建立脓毒症免疫抑制小鼠模型,检测此模型小鼠在细菌内毒素脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)注射后不同时间机体的免疫状态,确定LPS注射后引起严重免疫抑制的时间,在此基础上研究脓毒症后期小鼠体内调节性T细胞(Tregs)在免疫抑制中形成的作用和调控Tregs水平对脓毒症小鼠盲肠结扎穿刺(Cecal ligation-perforation,CLP)诱导的慢性或急性腹膜炎死亡率的影响。研究取得如下结果:1.LPS注射诱导的脓毒症小鼠具有典型的脓毒症免疫学特征通过不同剂量的LPS尾静脉注射诱导脓毒症小鼠模型。结果显示:注射剂量为1.25mg/kg体重的LPS可以诱导小鼠产生典型的脓毒症临床病变特征,并在脓毒症后期诱导机体出现免疫抑制。与注射1.25 mg/kg的小鼠相比,注射剂量为5 mg/kg LPS的小鼠可以表现出更为严重的临床症状和较长时间的恢复期,同时并不引起小鼠死亡。以注射5 mg/kg LPS的小鼠作为脓毒症动物模型,动态监测血液中关键炎症细胞因子的变化,结果显示,在LPS注射后早期(1~12 h),LPS脓毒症小鼠体内IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6、IL-10均显著升高,在LPS注射后24 h,这些细胞因子均显著下降;动态监测脾脏和血液中淋巴细胞的变化,结果显示,在LPS注射后24 h,脾脏和血液中T细胞、B细胞以及NK细胞数目均显著下降;在LPS注射后24 h的脓毒症小鼠,给予腹腔细菌感染,感染后1h和3h,血清中细胞因子IL-12、TNF-α、IFN-γ、IL-10水平显著低于生理盐水对照组小鼠腹腔感染后血液中细胞因子水平,并且脓毒症小鼠对感染的清除能力也显著低于对照组小鼠。以上结果表明,5 mg/kg LPS注射可诱导典型的LPS脓毒症小鼠模型,在LPS注射后24h,小鼠免疫状态表现为典型的免疫抑制或免疫麻痹。2.调节性T细胞(Tregs)在促进脓毒症后期免疫抑制的形成中发挥重要作用利用CD25抗体注射去除LPS诱导的脓毒症小鼠体内的Tregs细胞,检测Tregs细胞去除对脓毒症后期免疫抑制形成的影响。结果显示,与同型对照组LPS脓毒症小鼠相比,Tregs去除的LPS脓毒症小鼠,脾脏中的CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞比例显著增加;CD69阳性的CD4与CD8 T细胞和CD69阳性的NK细胞比例显著增加;与同型对照组小鼠相比较,Tregs去除的小鼠在LPS作用24 h后,取脾脏淋巴细胞体外给予IL-12刺激,IFN-γ阳性T细胞和NK细胞的比例显著增加。以上结果说明,Tregs的去除可以明显逆转LPS诱导的CD4+T细胞、CD8+T细胞以及NK细胞比例下降,并且提高LPS脓毒症小鼠后期T细胞和NK细胞的活性和反应性。3.降低脓毒症形成过程中Tregs细胞水平可有效地提高小鼠二次慢性感染后的抵抗能力小鼠在LPS作用24 h后用盲肠结扎穿刺(CLP)方式制造慢性腹膜炎。CLP二次打击72h后,发现脓毒症小鼠腹腔、血液和肺中的细菌数目与对照小鼠相比,高出两个数量级;Tregs去除的脓毒症小鼠经CLP二次打击后,腹腔、血液和肺中的细菌数目明显减少。在CLP 14天后,同型对照抗体处理的脓毒症小鼠存活率约为40%,而Tregs去除抗体处理的脓毒症小鼠存活率为70%以上,提高了约30%。以上结果表明,Tregs细胞的去除增加了脓毒症小鼠对后续慢性感染的抵抗力从而提高了LPS脓毒症小鼠在二次慢性感染中的存活率。4.去除脓毒症小鼠的Tregs细胞增加二次亚急性感染的敏感性和早期致死率LPS小鼠给予Tregs去除抗体后或者同型对照抗体之后,用CLP方式制造亚急性腹膜炎。Tregs去除小鼠与同型对照小鼠相比在二次亚急性感染早期表现出显著降低的存活率。以上结果表明,Tregs的去除会导致小鼠对二次感染的敏感性上升,从而增加了后续严重感染下的早期死亡率。本研究建立了LPS诱导的脓毒症小鼠模型,利用细菌感染以及CLP作为脓毒症免疫抑制期二次感染的方式,研究Tregs在脓毒症后期免疫抑制形成中的作用。结果发现,下调体内Tregs的数目能够在一定程度上抑制或者阻止脓毒症后期免疫抑制表型的形成,提高脓毒症后期小鼠的免疫反应性和抗感染能力,继而提高二次慢性感染中小鼠的存活率,但是却会增加二次亚急性早期的死亡率。本研究工作为进一步认识Tregs在重症感染性脓毒症形成中的调控作用和机制提供了理论支持,为探索以通过调节Tregs来改善机体免疫状态为导向的免疫调控治疗方法提供了理论指导。