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研究背景众所周知,心肌梗死是医学界公认的机体致病诱因之一,在全球范围内,每年由心衰病人造成死亡的总人数中有大约33%的人死于心肌梗死。一支主要的冠状动脉的堵塞能够导致心肺呼吸功能停止,从而造成心肌细胞的窒息,甚至出现炎性病变,严重的还会造成纤维化运动以及右心房的非典型收缩,左心室的非典型收缩会造成心肌缺血性心衰。更为重要的是,心衰病人的术后恢复情况都不理想。因此,如何有效的减轻心肌梗死后的心室重构成为治疗缺血性心脏疾病的新的希望。G蛋白信号调节因子5(RGS5)作为一种G蛋白介导信号的负性调节因子,在鼠科和人类成年心脏不同细胞里高度表达,其在胚胎发育、伤口愈合和生殖周期维护过程中发挥作用,并参与血管生成、血管外膜细胞成熟和心肌复极化,与高血压、动脉粥样硬化、心律失常和心肌缺血再灌注损伤的发病机理有关。然而RGS5在心肌梗死后对心脏功能和心脏重构所起的作用还不清楚。因此,我们通过这个实验来研究RGS5对心肌梗死后小鼠的心脏功能和心脏重构情况的影响及其作用机制。第一部分RGS5对小鼠心肌梗死后炎性反应、细胞凋亡及心肌纤维化的影响及机制研究目的:越来越多的证据表明,炎症反应及细胞凋亡在心肌梗死后心室重构过程中起着重要作用,并促使心衰的发生。本实验旨在探讨RGS5对在体小鼠心肌梗死后炎性反应、细胞凋亡及心肌纤维化的影响并探讨可能的机制。方法:通过结扎C57BL/6小鼠和RGS5基因敲除小鼠(RGS5 KO)的冠状动脉前降支来建立心梗模型。心梗模型分为4个实验组:C57BL/6假手术组(WT Sham),C57BL/6 手术组(WT MI),RGS5 KO 假手术组(RGS5 KO Sham),RGS5 KO手术组(RGS5 KO MI)。利用Western blot方法来检测梗死后心肌中RGS5的表达水平;利用TTC染色方法来计算心肌梗死后1天的梗死面积;利用HE和Masson染色测定心肌损伤程度;利用小鼠心功能超声检测方法来计算梗死后7天心功能的变化;利用原位末端转移酶标记技术(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay TUNEL)检测梗死后 7 天心肌细胞的凋亡;利用RT-PCR来测定炎性因子(TNF-a,IL-1β,IL-6),心肌纤维化标记物(CTGF,collagen I,and collagen III)表达情况。利用免疫印迹测MI后RGS5、T-IκBα、P-IκBα、T-p65、P-p65、T-p38、P-p38、T-JNK1/2、P-JNK1/2、T-ERK1/2 及 P-ERK1/2 的表达。结果:研究表明与WT组组小鼠相比,在MI后RGS5基因缺失小鼠可显著地降低心肌梗死后存活率与左心室(LV)的功能,增加心肌梗死面积。此外RGS5基因敲除小鼠表现出更大的炎症、细胞凋亡与心室重构,如炎性因子(TNF-a,IL-1β,IL-6),TUNEL染色和Bax/Bcl-2比值以及心肌纤维化标记物(CTGF,collagen I,and collagen Ⅲ)表达升高。机制上RGS5缺失激活的病理反应主要通过影响NF-ιB和MAPK信号通路引起的,比如磷酸化的p65和IκBα水平,ERK1/2磷酸化水平、JNK1/2和p38水平在RGS5-KO MI小鼠增加明显。结论:本研究证实RGS5对在体小鼠心肌梗死后炎性反应、细胞凋亡及心肌纤维化的起保护作用,其机制是通过NF-κB和MAPK信号通路引起的。第二部分RGS5通过血管再生对小鼠心肌梗死后心室重塑和心功能的影响及机制研究目的:探索RGS5是否通过血管再生对小鼠心肌梗死后心室重塑和心功能的影响及机制研究。方法:通过结扎C57BL/6小鼠和RGS5基因敲除小鼠(RGS5KO)的冠状动脉前降支来建立心梗模型。心梗模型分为4组:C57BL/6假手术组(WT Sham),C57BL/6 手术组(WTMI),RGS5 KO假手术组(RGS5KOSham),RGS5 KO 手术组(RGS5 KO MI)。利用TUNEL法检测术后7天各组小鼠心肌细胞凋亡程度;用CD31免疫组化染色检测心肌梗死后7天周边区微血管密度相比较,评价实验小鼠心肌组织血管新生情况;利用超声心电图评价术后30天各组小鼠射血分数、短轴缩短率、舒张末期内径及收缩末期内径参数;切片行HE染色观察心肌组织形态学变化,并计算各组小鼠心肌梗死的百分比;Masson染色法评价各组小鼠心肌纤维化的程度;利用Western blot检测术后30天小鼠心肌组织中PI3K/AKT、VEGF、eNOS蛋白表达情况;利用EMSA检测术后30天心肌细胞中HIF-1 α的含量。结果:研究表明与WT组小鼠相比,在MI后RGS5基因缺失可显著地降低心肌梗死后的微血管密度使血运重建减少、恶化了心功能并降低心肌细胞凋亡率,如CD31标记的微血管密度值减少,TUNEL染色和心肌纤维化程度CSA值升高。此外,RGS5基因缺失降低了 Akt的磷酸化,降低了细胞外信号调节激酶(ERK)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、hypoxia-induciblefactors1(HIF-1α)和血管内皮生长因子(VEGF)的表达,并降低了心肌梗死后HIF-1α与DNA结合活性。结论:RGS5基因缺失通过降低新生血管生成恶化了心功能及促进了心室重塑其RGS5基因缺失可以抑制血管生成通路的重要因子PI3K/Akt、ERK、HIF-1α、VEGF和P-eNOS,说明RGS5的心脏保护作用是通过血管生成信号通路完成的。