1研究目的基于Ca2+信号通路基因表达改变可能是増龄果蝇心脏功能衰退和运动抗心脏功能増龄衰退的潜在机理之一的设想,利用定位UAS-RNAi系统筛选増龄果蝇心功能密切相关心肌Ca2+信号调控基因。以筛选结果为基础,研究候选基因Ca MKII心肌沉默对増龄果蝇心脏运动适应效应的影响,从心脏功能,活动指数,攀爬能力和生命周期四个方面综合评价Ca MKII基因在运动延缓心脏功能増龄衰退效应中的作用。2研究方法经过同源基因查找及比对分析,选定与哺乳动物心肌细胞Ca2+信号通路高度保守的果蝇基因作为目标基因。基于定位UAS-RNAi系统,将心脏特异性Gal4品系果蝇分别与UAS序列控制下Ca2+信号基因RNAi品系果蝇杂交,构建单个Ca2+信号基因心肌组织沉默品系果蝇。采用M-mode方法对1周龄(约为人类青少年时期)和5周龄(约为人类中老年时期)成体果蝇心脏功能衰退相关FS、AI、FL等指标进行检测,筛选出増龄果蝇心功能密切相关心肌Ca2+信号调控基因作为候选基因。构建候选基因Ca MKII心肌组织沉默表型,全身沉默表型和正常表达品系,每个品系设安静对照组和运动组。应用新型果蝇运动装置对运动组果蝇进行为期3周规律运动训练,采用M-mode方法观察安静对照组和运动组运动训练期前后心脏功能増龄衰退相关缩短分数、节律不齐指数、纤维性颤动时间等指标变化。在果蝇运动训练期结束后,使用DAMS3系统监测每个组别果蝇昼夜活动节律变化,摄像评定果蝇攀爬能力,统计不同组别果蝇存活率,制作生存曲线,综合研究Ca MKII基因在运动延缓心脏功能増龄衰退效应的作用。3研究结果3.1黑腹果蝇Ca MKII基因与其人类同源基因Ca MKIIδ功能保守性分析结果果蝇Ca MKII基因的12种剪切体亚型与人类同源基因Ca MKIIδ的剪切体亚型序列对比结果显示,序列一致性均在74%以上,序列相似性均在82%以上,Blast序列相似性得分较高,确定果蝇Ca MKII基因与人类同源基因Ca MKIIδ高度保守。3.2 q RT-PCR检测结果Real-time PCR结果显示,Hand>UAS-Ca MKII RNAi-C果蝇心脏Ca MKII表达量相对于Ca MKII RNAi/+-C果蝇下降了79.70%;Arm/UAS-Ca MKII RNAi–C果蝇体内Ca MKII表达量相对于Ca MKII RNAi/+-C果蝇下降了64.54%。3.3心脏功能检测结果随着年龄的增长,果蝇HP和DI延长,FS降低,AI和FL上升。2周龄或4周龄心肌特异性Ca MKII敲低果蝇FS较同龄Ca MKII基因正常表达果蝇显著下降;4周龄或6周龄Hand>Ca MKII RNAi-C组果蝇AI较Ca MKII RNAi/+-C组果蝇上升;不同周龄Hand>Ca MKII RNAi-C组果蝇较同龄Ca MKII RNAi/+-C组果蝇FL上升。Ca MKII RNAi/+-E组果蝇FS和DD相对于Ca MKII RNAi/+-C组果蝇显著增高;Hand>Ca MKII RNAi-E组果蝇AI较Hand>Ca MKII RNAi-C组果蝇显著下降。3.4昼夜活动节律监测结果LD条件或DD条件下,运动组果蝇黑夜睡眠时间较同基因型对照组果蝇显著延长。3.5攀爬能力检测结果6周龄或7周龄心肌Ca MKII基因敲减果蝇攀爬能力显著低于同龄Ca MKII基因正常表达组(P<0.001);6周龄Ca MKII RNAi/+-E组果蝇攀爬能力较同龄同基因型对照组果蝇明显下降(P<0.001);不同周龄Hand>Ca MKII RNAi–E组果蝇攀爬能力均明显低于Hand>Ca MKII RNAi–C组果蝇(P<0.001)。3.6生命周期检测结果Hand>Ca MKII RNAi-C组果蝇中位生存期为55天与中位生存期为67天的Ca MKII RNAi/+-C组果蝇相比差异明显(图14 A);Hand>Ca MKII RNAi-E组果蝇中位生存期为64天,显著高于Hand>Ca MKII RNAi-C组中位生存期为55天果蝇。4结论4.1心肌组织Ca MKII基因正常表达对于维持増龄果蝇心脏功能、运动能力、生命周期十分重要,心肌组织Ca MKII基因长期低表达加速了心脏功能和运动能力的増龄衰退,同时果蝇生命周期缩短。4.2 3周规律运动显著延缓了果蝇心脏泵血能力的増龄下降,同时延长了果蝇晚间睡眠时间,提示运动适应效应同样适用果蝇。4.3 3周规律运动可能通过心肌细胞Ca MKII通路途径介导心肌肌力作用,影响果蝇心肌泵血能力。