棉花是一种重要的经济作物,在日常生活中有重要的应用价值。棉花D-7蛋白属于第三组胚胎发育晚期富集蛋白(LEA)家族的成员,有研究表明第三组LEA基因是一个诱导基因,在种子成熟后期高表达,在营养组织中受干旱、ABA、高温、低温等诱导表达,推测该基因的启动子上会有较多的诱导元件。本实验室前期工作已经获得了LEA基因上游1876bp的D-7基因启动子序列,利用生物信息学分析其含有CAAT-box、TATA-box、LTR、ABRE和HSE等顺式作用元件,通过遗传转化确定对干旱、低温、盐和ABA等不同的非生物胁迫有响应。本课题在此基础上,构建了系列D-7基因启动子5’端缺失片段(392bp、355bp、312bp、247bp、 173bp、92bp)与eGFP连接的表达载体,利用瞬时表达系统和农杆菌介导拟南芥的遗传转化实验检测上述启动子活性,寻找D-7启动子核心区,为改造和利用该启动子奠定基础。实验取得的结果如下：1、根据D-7基因启动子序列设计了6对5’端缺失片段的引物,通过PCR的方法,构建了6个5’端缺失片段(392bp、355bp、312bp、247bp、173bp、92bp)与eGFP连接的表达载体。并成功将D-7启动子5’端缺失片段与eGFP连接的表达载体转入农杆菌GV3101和LBA4404。2、通过棉花子叶瞬时表达系统检测了报告基因eGFP表达量,确定了共培养4天时,子叶中eGFP荧光表达最强,为棉花子叶瞬时表达系统的最佳共培养天数；对系列D-7启动子活性分析,结果初步确定在D-7启动子的247bp和173bp处eGFP荧光最强。3、通过农杆菌GV3101介导拟南芥遗传转化的方法,获得了6个D-7启动子5’端缺失片段与eGFP连接的转基因拟南芥植株,经抗性筛选及分子鉴定,成功获得了T2代纯系植株。4、利用倒置荧光显微镜观测了T2代转基因拟南芥各组织部位的荧光表达,结果显示,转系列D-7启动子拟南芥中,eGFP只在叶片和种子中表达；在种子中,随种子的成熟,eGFP的表达出现并增强,转392bp、355bp、312bp启动子拟南芥种子在15天时开始出现绿色荧光；转247bp、173bp、92bp启动子的拟南芥种子在12天时开始出现绿色荧光,其中转247bp启动子在12-18天时,种子表达的荧光强度明显强于其它5个截短体。5、对转系列D-7启动子拟南芥的干旱诱导性分析结果显示,干旱处理能增加eGFP的表达强度,且eGFP在转247bp启动子的拟南芥中表达最强；通过Real-time PCR的方法检测了T2代转基因拟南芥叶片中eGFP的相对表达量,结果表明干旱可诱导系列D-7启动子驱动eGFP表达,在干旱胁迫诱导下,312bp、247bp的D-7启动子驱动的eGFP表达量最高,推测247bp可能是干旱响应的最强活性区,但247-312bp的序列是否是D-7的核心启动子区,还有待于进一步的深入研究。