肿瘤坏死因子(TNF-α)是激活的单核-巨噬细胞分泌的一种细胞因子,它具有广泛的生物学活性,因此从发现至今一直是研究的重点。但是其生物学活性的两面性,又使它在临床应用中有很大的限制,于是人们通过构建其突变体的方法,以期增强其抗肿瘤活性并降低其毒副作用。本实验就是在对人TNF-α研究的基础上进行的。我们首先获得了家猪TNF-α基因的CDS区全长,通过PCR的方法构建得到了前7个氨基酸残基缺失,8位Ser、9位Asp、156位Leu分别突变为Lys、Arg和Phe的TNF-α突变体基因(标记为PmTNF-α)。分别构建了野生型和突变型TNF-α原核表达载体,并得到了高纯度的重组蛋白。用质谱法分析了突变体重组蛋白的分子量为16.7kDα。CCK-8法和流式细胞术检测了野生型和突变型TNF-α重组蛋白对L929细胞的细胞毒活性,证明突变型蛋白对肿瘤细胞的细胞毒活性明显增强。我们又用酶标法检测了两种重组蛋白刺激L02细胞分泌LDH的情况,证明了突变体蛋白的毒副作用有所降低。最后我们对两种重组蛋白进行了溶血性分析,突变型蛋白和野生型蛋白相比溶血性没有明显的增强。通过本实验,我们构建出了一种活性明显增强的猪TNF-α突变体蛋白,为以后用其作为家猪免疫增强剂或免疫佐剂,以及疾病治疗提供了一定的实验基础。