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寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)导致婴儿小头症且与神经系统疾病相关,目前无安全有效的疫苗上市。研究表明,预存的登革病毒抗体可交叉加重寨卡病毒感染,提示传统的全病毒减毒活疫苗和灭活疫苗策略对寨卡病毒是可能是无效的。所以,我们提出一种新型寨卡疫苗的研制策略:以寨卡病毒特异且与登革病毒无交叉的E蛋白第Ⅲ结构域(EDⅢ)为疫苗设计靶点,以T7噬菌体为疫苗载体,通过将寨卡病毒EDⅢ蛋白展示在噬菌体表面,构建成与登革病毒无交叉抗体反应且能针对寨卡病毒提供中和保护的新型寨卡疫苗。T7噬菌体是一种广泛应用在生命科学领域的一种工程载体,其易于培养,基因组较小,方便基因工程操作。噬菌体载体能够有效展示外源基因而不影响噬菌体的感染特性,同时又保留外源基因产物的结构和生物学功能,是新型疫苗的理想载体。噬菌体载体疫苗与传统疫苗相比,具有成本低、理化特性稳定、安全可靠、免疫效果好等优点。[目的]在本实验中,利用噬菌体展示系统研究展示EDⅢ蛋白的重组噬菌体T7-zEDⅢ寨卡疫苗株的生物学特性,同时对其免疫原性进行研究。[方法]本文用基因重组技术将寨卡病毒包膜蛋白(Envelope,E蛋白)第三结构域(EDⅢ)的基因与T7噬菌体10-3b的10B衣壳蛋白基因融合,使EDⅢ蛋白与T7 10B蛋白融合表达,构建重组噬菌体疫苗。通过PCR和测序方法鉴定重组噬菌体是否构建正确,利用Western blot技术检测重组噬菌体是否表达外源蛋白EDⅢ。将鉴定成功的重组噬菌体单克隆加入到处于对数期的大肠杆菌BLT5403中,扩大培养。采用PEG8000将重组噬菌体沉淀后重悬得到高浓度纯化噬菌体,并利用双琼脂夹心法测定噬菌体滴度。通过电镜观察重组噬菌体形态,并且研究重组噬菌体在不同pH、温度下的活性。利用不同滴度的重组噬菌体感染宿主菌测定最佳感染复数,通过连续传代来研究噬菌体的遗传稳定性,并通过噬菌体在宿主菌中的扩增研究噬菌体一步生长曲线。将纯化过的噬菌体经甲醛灭活后与氢氧化铝佐剂混合制成疫苗,以1012pfu/mL经腹腔注射免疫6周龄的BABL/小鼠,并在首次免疫的第二周加强免疫。设置空载体对照组和空白对照组。在免疫的第0、2、4、6、8、10周采集小鼠血清进行ELIAS实验,测定小鼠血清中抗体的含量。同时测定小鼠血清能否特异结合寨卡病毒颗粒。利用ELISPOT检测免疫后小鼠脾细胞IL-2和IFN-γ的表达,评价疫苗诱导的细胞免疫水平。[结果]经过PCR与Western blot检测确定重组噬菌体能够正确的表达外源蛋白zEDⅢ,将重组噬菌体株命名为T7-zEDⅢ。经纯化后T7-zEDⅢ滴度可达7×1012pfu/mL以上。通过对重组噬菌体生长特性的探究,发现重组噬菌体T7-zEDⅢ适应pH范围较广,最适pH为7。研究其热稳定性发现在40℃、50℃下较为稳定,其最佳的感染复数为0.001～0.00001,在10代、20代、30代重组噬菌体上都能检测到外源基因与蛋白,通过研究一步生长曲线,得到重组噬菌体T7-zEDⅢ的爆发期在90min,其裂解量为23pfu/cell。将重组噬菌体制作为疫苗后免疫小鼠,采各周血样ELISA检测血清抗-EDⅢ IgG效价,首次免疫第二周可达1:8000,加强免疫后第四周达到1:128000,第六周保持在1:128000,第八周为1:64000,第十周为1:32000,第23周稳定在1:32000,与对照组相比较疫苗在小鼠体内能诱导较高的特异性抗体水平,并且抗体水平能维持较长的时间。ELISPOT结果显示,在免疫24周后经寨卡病毒与EDⅢ蛋白刺激小鼠脾细胞均不能引起细胞因子IL-2和IFN-γ的高表达。[结论]成功构建了展示寨卡病毒E蛋白第三结构域的重组噬菌体T7-zEDⅢ,且能够稳定的遗传给噬菌体子代。在小鼠免疫实验中,展示出良好的免疫原性,可以诱导较高水平的特异性抗体。