【摘 要】
：
伪狂犬病（Pseudorabies）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染动物引起的一种急性传染病。目前,伪狂犬病没有有效的药物可以治疗,疫苗免疫依然是防控该病的主要手段。自2011年以来,伪狂犬病在部分地区的免疫猪场发生并且很快席卷全国各地。从感染伪狂犬病猪场分离的流行毒株,经鉴定为伪狂犬病毒突变株。研究表明以Bartha-K61为代表的现有疫苗已经不能对猪群流行毒株
【基金项目】
：
广东省科技计划项目（2016A020210046,2016B090921009）；
论文部分内容阅读
伪狂犬病（Pseudorabies）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）感染动物引起的一种急性传染病。目前,伪狂犬病没有有效的药物可以治疗,疫苗免疫依然是防控该病的主要手段。自2011年以来,伪狂犬病在部分地区的免疫猪场发生并且很快席卷全国各地。从感染伪狂犬病猪场分离的流行毒株,经鉴定为伪狂犬病毒突变株。研究表明以Bartha-K61为代表的现有疫苗已经不能对猪群流行毒株的感染提供有效的保护。因此,研发针对流行突变毒株的疫苗显得尤为重要。本研究以rPRV-AH-gI-/gE-株为亲本毒株,利用同源重组技术,缺失TK基因和在gE/gI基因缺失的位置插入PRV gC基因表达盒,获得rPRV-AH-TK-/gI-/gE-毒株和rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+毒株,并分析重组病毒生物学特性和评估其免疫效力。主要研究内容如下:1.重组病毒rPRV-AH-TK-/gI-/gE-、rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+的构建以PRV-AH株基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增TK基因缺失同源臂LA1、RA1,先后插入pMD-18 T载体,构建重组质粒pMD-LA1-RA1。以pEGFP-N1为模板扩增EGFP表达盒,构建表达绿色荧光蛋白的转移质粒pMD-LA1-EGFP-RA1。利用脂质体法将质粒pMD-LA1-EGFP-RA1转染于BHK-21细胞,然后接种rPRV-AH-gI-/gE-毒株,通过绿色荧光蛋白为筛选标记获得重组病毒rPRV-AH-TK-/EGFP+/gI-/gE-。为了删除EGFP基因,采用相同方法,使rPRV-AH-TK-/EGFP+/gI-/gE-和质粒pMD-LA1-RA1发生同源重组,通过筛选获得不含EGFP基因的重组病毒rPRV-AH-TK-/gI-/gE-。采用上述类似方法分别构建gI/gE基因缺失重组转移质粒pMD-LA-RA、pMD-LA-EGFP-RA。利用同源重组技术,使rPRV-AH-TK-/gI-/gE-毒株和质粒pMD-LA-EGFP-RA发生同源重组,筛选并获得rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/EGFP+。在实验室前期构建的重组质粒pgC-N1（以PRV-AH株gC基因编码区替换pEGFP-N1质粒的EGFP基因编码区）基础上,将His标签引入gC编码区序列（CDS）的5’末端,构建重组质粒pgC-His-N1。通过PCR扩增PCMV-gC-SV40poly A表达盒,插入转移质粒pMD-LA-RA,构建质粒pMD-LA-gC-RA。采用同源重组技术,使rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/EGFP+和质粒pMD-LA-gC-RA发生同源重组,通过筛选获得重组病毒rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+。2.重组病毒的生物学特性研究将rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+和rPRV-AH-TK-/gI-/gE-进行连续传代培养,取第1、10、15代应用PCR进行鉴定,结果显示,重组病毒遗传稳定性良好。绘制rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+、rPRV-AH-TK-/gI-/gE-和PRV-AH毒株的一步生长曲线,结果表明,两株重组病毒与亲本毒株的生长动力学基本相似,无显著差异。应用Western blot技术对插入的PRV gC表达盒进行蛋白表达水平鉴定,结果显示,插入的gC基因能正常表达。3.重组病毒的免疫效力及攻毒保护效果评价用rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+、rPRV-AH-TK-/gI-/gE-接种4周龄的昆明小鼠,接种剂量分别为10~5TCID50、10~6TCID50和10~7TCID50。结果显示,小鼠均未出现PRV临床症状及死亡,表明两株重组病毒对小鼠的安全性良好。用PRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+、rPRV-AH-TK-/gI-/gE-免疫4周龄昆明小鼠,免疫剂量分别为10~5TCID50和10~6TCID50,同时设立商品疫苗对照组。首免后第21 d进行二免,二免后第28 d用10~6TCID50PRV-AH株进行攻毒。中和实验结果显示,在相同免疫剂量下,rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+免疫组比rPRV-AH-TK-/gI-/gE-免疫组产生的中和抗体水平更高（p＜0.05）。攻毒实验结果显示,10~5TCID50和10~6TCID50rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+对小鼠的攻毒保护率均为75.0%,在所有免疫组中攻毒保护率最高。综上所述,双拷贝gC基因的重组病毒rPRV-AH-TK-/gI-/gE-/gC+能引起更高水平中和抗体的产生,且对免疫小鼠可以提供更好的保护效果,有望作为一种新的疫苗候选株用于当前伪狂犬病的防控。
其他文献
狂犬病是一种急性、致死性神经系统疾病,其病原是狂犬病病毒（RABV）,大部分陆生哺乳动物均能感染。感染后一旦出现临床症状,死亡率达100%,是大多数发展中国家和地区的重大公共卫生问题。据世界卫生组织（WHO）估计,全世界每年有约6万人死于狂犬病。RABV编码五个结构蛋白,其中G蛋白是决定毒力和诱导机体产生中和抗体的唯一蛋白,因此,开展G蛋白表达的研究可为构建高效、安全的疫苗奠定基础。本研究用连接子
禽白血病（avian leukosis,AL）是由禽白血病病毒（avian leukosis virus,ALV）引起发病鸡生产性能下降、产生免疫抑制、发生良性或恶性肿瘤的家禽传染性疾病,是危害养禽业健康发展的重要疾病之一。由于ALV可通过垂直传播和水平传播方式扩散且无商业化的疫苗或药物防治,现阶段国内外防控AL主要是通过净化种鸡群。自2012年起,从我国部分地方品种鸡中陆续分离出与已知ALV不同
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种专性胞内寄生虫,可导致免疫缺陷患者患病。弓形虫在中间宿主中有两种形式存在,分别是急性感染期的速殖子和慢性感染的缓殖子。在免疫缺陷宿主中,弓形虫的潜伏感染可从组织包囊中重新激活。包囊内存在大量支链淀粉,确保弓形虫在缺乏营养物质的情况下维持其生存。在支链淀粉代谢过程中,有许多淀粉代谢酶参与。其中,4-α-葡聚糖转移酶（4-alpha-glucano
新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的新城疫（Newcastle disease,ND）是禽类的急性、败血性和高度接触性传染病,主要感染鸡与火鸡,对全球的家禽养殖业造成了巨大的经济损失。NDV强毒株入侵机体时,一方面会诱导机体激发过强的炎症反应,产生细胞因子风暴,进一步损害宿主组织,增加禽类的发病率和死亡率;另一方面,宿主细胞启动自噬对NDV的病毒成分进行包裹和
钩虫病是一类被忽视的重要寄生虫病,锡兰钩虫是唯一一种可在人体内发育为成虫并能引起人的腹泻、贫血等症状的动物源性钩虫。谷胱甘肽-S-转移酶（glutathione-S-transferase,GSTs）是与细胞解毒与抗氧化有关的一种多功能酶,也是蠕虫主要解毒酶之一。GSTs不仅对内源性或宿主产生的有毒产物发挥重要的解毒作用,而且还可作为抗寄生虫感染的疫苗候选分子或药物靶标。因此,本研究对锡兰钩虫谷胱
十二指肠贾第虫（Giardia duodenalis）和毕氏肠微孢子虫（Enterocytozoon bieneusi）是重要的人兽共患病原,可导致人和多种动物腹泻。犬和猫是以上两种病原的重要宿主,但目前国内有关犬猫中两种病原的研究非常有限。因此,本研究采用分子生物学方法,在我国犬猫数量最多的广东省,进行犬猫中以上两种病原的分子流行病学调查,解析两者在犬猫中的流行情况及基因型分布特征,以评估感染风
锡兰钩虫（Ancylostoma ceylanicum）寄生于犬猫和人的小肠,是一种可在人体内发育为成虫的动物源性钩虫,可导致人营养不良和缺铁性贫血等症状。钩虫血小板抑制剂（Hookworm platelet inhibitor,HPI）是一种钩虫分泌蛋白,可抑制人的肠道血管血小板聚集与粘附,便于钩虫吸血而获取营养,具有较强的致病性,并可作为钩虫疫苗的候选分子。本论文研究了锡兰钩虫血小板抑制剂（A
沙门菌是一种重要的人兽共患病原菌,迄今已发现超过2600种血清型,鼠伤寒沙门菌是其中优势的血清型之一,在世界各地广泛流行。鼠伤寒沙门菌来源广泛,可在人和动物间通过食品链交叉感染,因具有较强的耐药性和致病性,给动物和人类健康带来极大挑战,具有重要的公共卫生意义。目前,我国对于不同ST分型沙门菌与耐药性、生物被膜的相关研究仍缺乏数据支持,常规耐药机制的研究不能满足日益严重细菌耐药性的需要。因此本研究旨
禽白血病（Avian leukosis,AL）是一类由禽白血病病毒（Avian leukosis virus,ALV）引起发病鸡生产性能下降、发生肿瘤和死亡的禽类传染性疾病。目前发现感染鸡群的ALV可分为A、B、C、D、E、J和K等,其中J亚群（Subgroup J avian leukosis virus,ALV-J）为我国主要流行亚群。ALV-J致病性高,常伴有多重感染和继发感染,直接影响生产
猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome,PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV）引起的一种严重影响全球养猪业的病毒性传染病。根据病毒基因组和抗原性的差异,PRRSV分为欧洲型（基因1型）和北美型（基因2型）。200