沙门菌主要通过污染水和食品引人致病,是世界上最常见的引发水源性和食源性疾病爆发的致病菌,具有十分重要的公共卫生学意义。沙门菌感染已经成为世界范围内的公共卫生问题,其危害性日益受到人们重视。目前,我国沙门菌检测依然以传统的细菌分离方法为主,检测周期为5-7天,操作繁琐和耗时长,不利于沙门菌感染爆发时的预防和控制。光纤生物传感器能满足致病菌的快速检测需要,为沙门菌的快速检测提供一种新的方法。研究目的1.利用光纤生物传感器具有现场快速检测的优势,初步建立沙门菌的快速检测平台,可为沙门菌和其他常见致病菌的快速检测提供技术平台。2.采用杂交瘤细胞技术,制备肠炎沙门菌单克隆抗体,并对该抗体的特异性、浓度、效价和单抗亚型进行鉴定。3.利用实验室制备的肠炎沙门菌单克隆抗体,依托光纤生物传感器具有快速检测的优势,建立肠炎沙门菌的快速检测方法。研究内容和方法1.研究光纤生物传感器快速检测水中沙门菌的方法,采用生物素标记的多克隆抗体为捕获抗体,Alexa Fluor647荧光素标记的沙门菌多克隆抗体为检测抗体,结合亲和素-生物素系统的放大效应,采用双抗体夹心免疫反应模式进行沙门菌检测。对捕获抗体浓度和检测抗体的浓度进行了优化实验,确定了本实验所用的最佳检测条件,对方法的灵敏度和特异度进行了评价,同时对环境水样进行加标后检测,验证方法的灵敏度和特异度。2.采用小剂量长周期的免疫方案。以甲醛灭活的肠炎沙门菌为免疫原,采用梯度浓度剂量分组免疫12只小鼠,免疫途径采用小鼠腹腔注射,免疫剂量分别为2.5×108、5×107、1×107、5×106cfu,同时加入佐剂以刺激小鼠的免疫系统,观察小鼠的免疫效果。5次免疫之后,测量小鼠内眦静脉血,选择效价高的小鼠进行细胞融合,用间接ELISA方法筛选阳性孔,并对阳性孔进行亚克隆,经过3次亚克隆检测全阳性之后,最终获得抗肠炎沙门菌的单克隆细胞株。对获得的细胞株进行特异度检测,采用传统的正辛酸-饱和硫酸铵方法进行纯化,之后对其效价、浓度和单抗亚型进行鉴定。3.研究光纤生物传感器快速检测水中肠炎沙门菌的方法,用实验室制备的单克隆抗体做捕获抗体,Alexa Fluor647荧光素标记的沙门菌多克隆抗体为检测抗体,采用双抗体夹心免疫反应模式进行沙门菌检测。对捕获抗体的浓度、检测抗体的浓度、捕获抗体与抗原的反应时间、抗原抗体反应体系与检测抗体的反应时间进行了优化,确定实验所用的最佳检测条件,同时对方法的灵敏度和特异度进行评价。研究结果1.光纤生物传感器可以在40min内完成水中沙门菌的检测。该方法检测沙门菌的灵敏度为5.5×103cfu/mL,与非沙门菌(大肠埃希菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌和金黄色葡萄球菌)无交叉反应现象。对甲型副伤寒沙门菌(A型)、德尔卑沙门菌(B型)、鼠伤寒沙门菌(B型)、猪霍乱沙门菌(C型)、纽波特沙门菌(C型)、肠炎沙门菌(D型)、山夫登堡沙门菌(E型)等7种常见的代表性沙门菌高浓度(107cfu/mL)和低浓度菌液(103cfu/mL、102cfu/mL)进行了检测,107cfu/mL和103cfu/mL时均能获得明显阳性信号值。对无沙门菌的环境水样进行了加标检测,结果显示,加标后水样中的沙门菌浓度在4.2×103cfu/mL以上时,样品检测结果全为阳性。双倍TSB增菌实验表明,水样沙门菌浓度在50cfu/mL,6h增菌后菌液浓度为3.9×103cfu/mL,能得出阳性信号值,检测结果为阳性,继续增加增菌时间,检测结果仍为阳性。2.应用杂交瘤细胞技术制备一株稳定分泌肠炎沙门菌单克隆抗体的细胞株,命名为4G11。选择4G11进行腹水单克隆抗体的扩大生产,采用正辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水,抗体效价为1：8000,抗体浓度为1.972mg/mL,抗体亚型为IgG3。3.采用本实验室制备的单克隆抗体作为捕获抗体,利用光纤生物传感器可以在60min之内完成水中肠炎沙门菌血清型的检测。探索了捕获抗体的最优稀释度为1：1000,检测抗体的最优浓度为80μg/mL,捕获抗体与目标抗原最佳反应时间为10min,抗原抗体反应体系与检测抗体的最佳反应时间为20min,方法灵敏度为3.0×103cfu/mL。与106cfu/mL的猪霍乱沙门菌、阿贡纳沙门菌、纽波特沙门菌、甲型副伤寒沙门菌、德尔卑沙门菌、山夫登堡沙门菌、鸭沙门菌、大肠埃希菌、福氏志贺菌、痢疾志贺菌和金黄色葡萄球菌菌液之间不存在交叉反应。研究结论本研究初步建立了光纤生物传感器快速检测水中沙门菌的方法,为沙门菌污染严重的水样提供了一种快速检测的方法,同时为其他常见的致病菌的检测提供一个技术方法平台。利用实验室制备的肠炎沙门菌单克隆抗体建立了光纤生物传感器快速检测肠炎沙门菌的方法,为沙门菌流行优势血清型的检测提供了新的方法。