【摘 要】
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癌症是导致人类死亡的首要原因,其中肺癌的死亡率最高,2020年有近180万人死于肺癌。大多数药物治疗的最终目的是诱导肿瘤细胞发生凋亡。细胞凋亡的最终执行者是激活的caspase-3酶,它能水解胞内蛋白,破坏DNA链,使细胞形成凋亡小体后死亡。因此,对治疗后肿瘤细胞中caspase-3表达水平的实时监测有助于治疗疗效的早期评估。目前,灵敏度高、分辨率较好、组织穿透能力强的正电子发射计算机断层扫描（P
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癌症是导致人类死亡的首要原因,其中肺癌的死亡率最高,2020年有近180万人死于肺癌。大多数药物治疗的最终目的是诱导肿瘤细胞发生凋亡。细胞凋亡的最终执行者是激活的caspase-3酶,它能水解胞内蛋白,破坏DNA链,使细胞形成凋亡小体后死亡。因此,对治疗后肿瘤细胞中caspase-3表达水平的实时监测有助于治疗疗效的早期评估。目前,灵敏度高、分辨率较好、组织穿透能力强的正电子发射计算机断层扫描（PET）是公认的最为先进的无创成像技术,可在分子水平上评估生物靶点的表达水平和疾病状态。开发靶向caspase-3的PET探针为跟踪疾病进展和评估治疗疗效提供了重要依据。基于此,本文设计了三个不同标记方法的靶向caspase-3的PET显像探针,用于实时、动态、无创地评估药物诱导后肿瘤细胞的凋亡水平。首先,基于本课题组设计合成的探针骨架SF,连接caspase-3特异识别的底物序列Ac-Asp-Glu-Val-Asp（Ac-DEVD）,然后通过点击缩合反应引入标记基团[18F]azide,获得探针[18F]SF-DEVD-1。该探针能够特异性响应凋亡的肿瘤细胞内激活的caspase-3和高表达的谷胱甘肽（GSH）,底物序列DEVD被剪切且二硫键被还原,裸露出半胱氨酸上的巯基和氨基后与CBT发生点击缩合反应生成刚性和疏水性更强的分子内环化产物,进而自组装成纳米颗粒,增强探针在肿瘤细胞内的聚集和滞留效果。[18F]SF-DEVD-1在PBS和小鼠血清中均具有良好的稳定性。体外机制研究表明,探针在还原剂三（2-羧乙基）膦（TCEP）和激活的caspase-3共同作用下,能够进行分子内缩合并自组装成纳米颗粒。体外细胞摄取实验表明,经化疗药物阿霉素（DOX）治疗的非小细胞肺癌细胞对探针[18F]SF-DEVD-1的摄取为未治疗组的两倍左右。对DOX治疗后的小鼠进行PET显像时,我们在DOX响应的NCI-H460小鼠肿瘤部位观察到明显的放射性信号,10 min时摄取值达到5.2±0.3%ID/m L,1 h时为4.0±0.4%ID/m L,肿瘤与肌肉的摄取比（T/M）最大值为5.6±0.14;而在DOX不响应的NCI-H1299小鼠或未治疗的小鼠肿瘤部位则未见明显摄取,显像1 h内摄取值均低于2%ID/m L,T/M值均低于2,表明[18F]SF-DEVD-1不仅能够监测到化疗引起的肿瘤细胞凋亡,而且能够区分化疗响应和不响应的肿瘤类型。为了简化放射化学合成方法,我们引入1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）金属螯合剂替代[18F]azide作为显像基团,分别与Al18F或68Ga发生络合反应,开发了探针[18F]SF-DEVD-2和[68Ga]SF-DEVD-2,继续探究其检测凋亡水平的能力。与[18F]SF-DEVD-1相比,探针[18F]SF-DEVD-2和[68Ga]SF-DEVD-2的放射化学产率更高,分别为56±1.5%和85±1.2%,耗时更短,15-30 min内即可完成放射性标记。在体外PBS和小鼠血清中同样具有良好的稳定性;NOTA基团的引入增强了探针的亲水性,log P值分别为-1.76±0.04和-1.45±0.10,有利于减少探针在肝脏、肠道等部位的聚集;体外细胞实验结果显示,[18F]SF-DEVD-2和[68Ga]SF-DEVD-2在凋亡的肺癌细胞中的摄取为未凋亡细胞的两倍左右,且摄取值与[18F]SF-DEVD-1相当。在小鼠体内的PET显像中,[18F]SF-DEVD-2和[68Ga]SF-DEVD-2同样在DOX响应的NCI-H460小鼠肿瘤部位显示出较高摄取,10 min时摄取值分别为5.9±0.4%ID/m L和4.0±0.3%ID/m L,1 h时摄取值分别为5.1±0.4%ID/m L和4.7±0.3%ID/m L,在DOX不响应的NCI-H1299模型和未治疗小鼠肿瘤部位均无明显摄取,表明探针[18F]SF-DEVD-2和[68Ga]SF-DEVD-2能够监测治疗后肿瘤细胞中的caspase-3活性,从而对化疗的疗效进行实时、动态的评估。综上所述,三个探针均能灵敏且特异性地检测化疗引起的细胞凋亡,标记方法的优化使得探针的放射性合成更简便快捷,更具临床应用前景。
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