【摘 要】
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背景肥胖对人类健康危害巨大。防治肥胖,成为人类保卫健康的主要手段之一。肥胖常伴随脂肪组织内低级别慢性炎症的发生,从而导致肥胖相关的代谢性疾病。脂肪组织功能障碍导致血清游离脂肪酸异常升高,过量游离脂肪酸通过干扰胰岛素信号产生胰岛素抵抗。因此,有效调控炎症和胰岛素抵抗是控制肥胖进程的潜在手段。肝细胞分泌的甘露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin,MBL）在天然免疫防御中发挥重要作
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背景肥胖对人类健康危害巨大。防治肥胖,成为人类保卫健康的主要手段之一。肥胖常伴随脂肪组织内低级别慢性炎症的发生,从而导致肥胖相关的代谢性疾病。脂肪组织功能障碍导致血清游离脂肪酸异常升高,过量游离脂肪酸通过干扰胰岛素信号产生胰岛素抵抗。因此,有效调控炎症和胰岛素抵抗是控制肥胖进程的潜在手段。肝细胞分泌的甘露聚糖结合凝集素（Mannan-binding lectin,MBL）在天然免疫防御中发挥重要作用。近年研究发现MBL对机体免疫稳态的调节也发挥重要作用。前期研究证实,在3T3-L1脂肪细胞诱导分化的不同阶段,MBL均发挥负向调控作用,且与自噬密切相关。提示,MBL对肥胖的发生发展具有调控作用,但机制不清。本实验采用体内和体外实验系统探讨MBL对高脂诱导肥胖炎症及胰岛素抵抗的调节作用及机制,可为防治肥胖及相关代谢性疾病提供新方向。目的探讨MBL对肥胖炎症及胰岛素抵抗的调节作用及机制。方法1.体外实验,诱导3T3-L1前脂肪细胞分化,油红O染色观察细胞分化程度,使用CCK-8检测分化过程中不同浓度MBL和LPS对细胞增殖能力的影响。体内试验中,选用C57BL/6的野生型（WT）雄性小鼠与MBL基因敲除(MBL-/-)雄性小鼠,分别喂养高脂饲料和普通饲料,建立普通对照和高脂肥胖模型。2.检测炎性因子及炎症信号通路的表达:ELISA检测细胞炎性因子IL-6和TNF-α含量,Western blot检测细胞炎性因子IL-6、TNF-α和NF-κB信号通路中蛋白表达。使用Transwell对巨噬细胞的迁移情况进行检测。体内实验中,取各组小鼠的脂肪组织,Western blot检测动物脂肪组织中TNF-α和IL-6蛋白表达。3.检测MBL对细胞摄取葡萄糖能力及胰岛素信号通路蛋白表达情况:体外实验中,流式细胞术检测MBL对3T3-L1细胞摄取葡萄糖的调节作用;Western blot检测Akt、IRS-1 try蛋白磷酸化及GLUT4的表达情况。体内试验中,Western blot检测各组小鼠脂肪组织中Akt、IRS-1 try蛋白磷酸化及GLUT4的表达情况。4.检测MBL对脂肪酸氧化的调节:体外实验中,使用试剂盒检测细胞内乙酰辅酶A、ATP的含量;q RT-PCR检测LCAD的含量,Western blot检测ACC的磷酸化及CPT-1的蛋白表达情况。体内实验中,Western blot检测各组小鼠脂肪组织中ACC的磷酸化及CPT-1的蛋白表达情况。5.使用AMPK的药理抑制剂（compound C）来确定MBL在细胞炎症、胰岛素抵抗及脂肪酸氧化中的作用是否通过AMPK介导。对上述指标进行检测。结果1.成功诱导3T3-L1前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。细胞分化过程中,不同浓度MBL、LPS及compound C的干预对3T3-L1脂肪细胞增殖无明显影响。2.MBL在体外3T3-L1细胞中的调节作用（1）在3T3-L1脂肪细胞诱导分化过程中,ELISA及Western blot显示MBL可抑制LPS诱导的IL-6和TNF-α的表达,且呈浓度依赖方式;MBL可抑制LPS诱导的核NF-κB、TLR4的活化及IKK、IκB磷酸化。（2）Transwell实验证实,MBL可抑制巨噬细胞向脂肪细胞迁移。（3）Western blot证实MBL可增加胰岛素信号通路关键蛋白P-IRS、P-Akt及GLUT4的表达;流式细胞术显示MBL可缓解LPS对细胞摄取葡萄糖的抑制作用。（4）Western blot及q RT-PCR等实验显示,MBL可增加被LPS抑制的3T3-L1脂肪细胞中乙酰辅酶A、ATP和LCAD m RNA的含量及P-ACC和CPT-1蛋白的表达。（5）加入AMPK抑制剂compound C后,脂肪细胞中IL-6、TNF-α、核NF-κB、TLR4、P-IKK和P-IκB的表达增高,MBL对脂肪细胞的抑炎作用被部分抵消;compound C的干预使细胞摄取葡萄糖的能力被抑制,胰岛素信号通路的关键蛋白P-IRS-1、P-Akt、GLUT4的表达也被抑制,削弱MBL对细胞摄取葡萄糖的增强能力;且抑制脂肪细胞中ATP含量及P-ACC和CPT-1蛋白的表达,使MBL对脂肪酸氧化的刺激受到抑制。3.MBL基因敲除对高脂诱导肥胖小鼠的影响（1）Western blot证实,与高脂饮食野生型小鼠比,MBL基因敲除小鼠脂肪组织中的IL-6和TNF-α表达增高;（2）Western blot证实,与高脂饮食野生型小鼠比,MBL基因敲除小鼠脂肪组织中的P-IRS try、P-Akt、GLUT4和CPT1表达降低。结论1.MBL能够通过AMPK介导的途径减轻LPS诱导的脂肪细胞炎症和胰岛素抵抗。2.MBL能够有效抑制高脂诱导肥胖小鼠的炎症,改善胰岛素抵抗及增强脂肪酸的氧化。
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