【摘 要】
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高温胁迫会使昆虫(螨)产生大量活性氧(ROS),发生氧化损伤。抗氧化酶和热激蛋白等作为主要的抗氧化物质,可以减少昆虫(螨)体内过量ROS造成的伤害。截形叶螨Tetranychus truncatus作为河西玉米杂交育种田中的优势害螨,发现其在夏季繁殖迅速,且已对市面上的大多数杀螨剂产生抗性。实验室前期研究发现高温胁迫会对叶螨的生长、发育和繁殖造成一定的影响,并且引起了体内蛋白、保护酶等含量的变化。
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高温胁迫会使昆虫(螨)产生大量活性氧(ROS),发生氧化损伤。抗氧化酶和热激蛋白等作为主要的抗氧化物质,可以减少昆虫(螨)体内过量ROS造成的伤害。截形叶螨Tetranychus truncatus作为河西玉米杂交育种田中的优势害螨,发现其在夏季繁殖迅速,且已对市面上的大多数杀螨剂产生抗性。实验室前期研究发现高温胁迫会对叶螨的生长、发育和繁殖造成一定的影响,并且引起了体内蛋白、保护酶等含量的变化。因此本文主要从基因层面对截形叶螨雌成螨热胁迫后产生的差异基因进行分析,挖掘潜在的与热胁迫相关基因,并对其进行功能研究,为揭示其耐热机制奠定一定的基础。首先采用Illumina Hi Seq 4000对40℃高温胁迫后的截形叶螨敏感和抗性品系进行转录组测序,筛选出21条高温胁迫后在两品系中均差异表达的基因进行RT-q PCR验证;并对高温胁迫后显著表达的抗氧化酶基因Tt SOD、Tt POD3、Tt POD4和Tt GSTs2在不同高温(34℃、38℃和42℃)和螨态中基因的表达模式进行解析;并利用RNAi技术对抗性品系雌成螨40℃高温胁迫后高表达的Tt SOD和Tt POD4基因进行功能验证,主要结果如下:1.截形叶螨雌成螨抗性和敏感品系受到40℃高温胁迫后,敏感品系中共检测到17577个显著差异基因,其中12831个上调,4746个下调。抗性品系中共检测到26822个显著差异基因,13039个上调,13783个下调。GO功能分析发现两品系雌成螨高温胁迫后,差异基因主要在细胞过程(Cellular process)、催化活性(Catalytic activity)和细胞(Cell)等富集,KEGG通路富集分析结果表明,差异基因主要富集在代谢途径(Metabolic pathways)和溶酶体(Lysosome)等通路。从转录组测序数据中筛选出与高温存在关联的高表达基因主要有抗氧化酶(Antioxidant enzymes)和热激蛋白(Heat shock protein:Hsp)等基因。采用RT-q PCR技术检测这些基因后发现,17条基因的上下调趋势与转录组测序结果一致。两品系的截形叶螨雌成螨被热胁迫后,体内抗氧化酶基因和热激蛋白基因的表达量发生了变化,因此推测截形叶螨可能从能量代谢、抗氧化防御、分子伴侣等多方面应对高温胁迫。2.利用RT-q PCR技术对两品系截形叶螨在不同高温(34℃、38℃和42℃)下各螨态抗氧化基因的差异表达量进行分析,结果表明:截形叶螨抗性和敏感品系受到不同高温胁迫后,4个抗氧化酶基因的表达量均被高温胁迫诱导表达,并且,各螨态热胁迫后表达量因抗氧化酶基因和温度不同存在差异,说明基因的表达会因胁迫温度和发育阶段的不同而有所差异。3.利用RNAi技术对两个抗氧化酶基因(Tt SOD和Tt POD4)进行沉默效应研究,RNAi结果表明:ds Tt POD4和ds Tt SOD基因的表达被抑制,沉默效率分别为74.29%和49.95%;Tt POD4基因被沉默后,40℃高温胁迫后,叶螨的死亡率显著高于对照组,证明ds Tt POD4基因在截形叶螨抵抗高温胁迫时起重要作用。
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