论文部分内容阅读
目的： 肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病呈年轻化趋势。由于抗肿瘤药物毒副作用大、易产生耐药性，影响了在临床上的应用。夏枯草(Prunella vulgaris L.)为唇形科夏枯草属植物的干燥果穗，是一味传统抗肿瘤中药，其抗肿瘤作用是一个涉及多成分、多靶点、多途径的过程，调节这些过程的本质是基因，而最直接的作用者是蛋白质。本实验运用双向电泳技术和蛋白质谱技术，分析肺腺癌A549细胞和夏枯草作用后A549细胞蛋白质表达量或质的变化，从蛋白质组学水平探讨夏枯草抗肺腺癌的作用机制。 方法： 体外培养肺腺癌A549细胞，将其分成二组:正常对照组（不加夏枯草提取物）、实验组（夏枯草提取物用药组）。采用MTT比色法检测不同浓度夏枯草提取物对腺癌A549细胞增殖抑制作用，找到最佳夏枯草提取物作用浓度。加入此浓度夏枯草提取物检测不同作用时间下对肺腺癌A549细胞增殖活力的影响，找到最佳作用时间。以超声裂解细胞法分别提取两组细胞总蛋白，进行蛋白质双向电泳分离和凝胶硝酸银染色，进行3次重复测定。经UMAX ImageScanner凝胶扫描仪及LabScan软件进行图象扫描、Image Master2D Platinum6.0软件对获得的蛋白图谱加以分析，寻找差异表达蛋白质。切取差异蛋白表达点，经胶内酶解后，进行基质辅助激光电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析获得肽指纹图谱，用MASCOT软件(Matrix Science Ltd.)进行数据库搜索，得到差异蛋白质信息。 结果： 夏枯草提取物可明显抑制肺腺癌A549细胞的生长，且具有一定的量效关系。采用双向电泳技术建立正常对照组及夏枯草提取物作用后肺腺癌A549细胞蛋白质组图谱，结果显示:正常对照组3块凝胶的平均蛋白质点为1585个，加药组3块凝胶的平均蛋白质点为2108个。选取所有胶上分辨清楚且组内3炔胶中均出现的蛋白质点进行两组间差异分析，共筛选出具有明显差异的蛋白质点40个，其中3倍以上差异点18个，有和无差异点3个。经过胶内酶切后用MALDI-TOF-MS进行检测，得到如下结果: 1、在实验组中表达上调的蛋白有:Type1 inositol1，4，5-trisphosphatereceptor、Heat shock cognate protein70、Tumor protein p53、T-cell receptordetla chain、Tropomyosin2(beta) isoform1和Cyclin B3; 2、在实验组中表达下调的蛋白有: Enolase1、M2-type pyruvate kinase和Heat shock protein27。 结论： 夏枯草提取物通过“多靶点、多途径”发挥抗肺腺癌A549细胞的作用，具体机制可能是: 1、通过调节烯醇化酶-1、肿瘤2型丙酮酸激酶，干扰肺腺癌A549细胞内能量代谢，降低细胞糖酵解和磷酸化能力，抑制细胞生长。 2、通过调节细胞周期蛋白B3的表达影响肺腺癌A549细胞周期，阻滞细胞从G1期想2S期过渡，抑制细胞生长。 3、通过调节1，4，5-三磷酸肌醇受体1型、β-原肌球蛋白的表达影响肺腺癌A549细胞信号转导，激活内钙过度释放，引起细胞损伤。 4、下调热休克蛋白27，促进肺腺癌A549细胞凋亡。 5、下调p53基因表达，抑制肺腺癌A549细胞分裂，降低细胞稳定性。 6、上调热休克同源性70、T细胞受体δ链，增强抗肿瘤免疫调控能力。