副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp),是一种广泛分布于水产品中的革兰氏阴性嗜盐菌。是一种主要的食源性致病微生物,由它引起的食品安全事件逐年上升。随着抗生素在临床治疗和渔业养殖中推广使用,副溶血弧菌对抗生素的耐药现象日益严重。喹诺酮类抗生素在弧菌病的治疗与预防中应用广泛,副溶血弧菌此类药物的耐药性日趋显著。目前,副溶血弧菌对喹诺酮类抗生素的耐药机制研究较少。本研究通过比较诱导耐药前后菌株的MIC值,生长曲线,gyrA、parC基因的喹诺酮耐药决定区序列,RND型外排泵的表达量变化以及始发菌株的全基因组测序和分析,初步解析了副溶血弧菌对喹诺酮类药物的耐药分子机制,主要研究内容和结果如下:(1)体外多步诱导前后菌株耐药表型的变化采用环丙沙星、氨苄青霉素、四环素、ε-聚赖氨酸、茶多酚,分别对始发菌株F7进行体外多步诱导,最终获得四个系列耐药菌株(本研究中未得到茶多酚诱导耐药菌株)。对诱导前后菌株MIC值的比较,发现抗生素类药物更容易诱导副溶血弧菌产生多重耐药:环丙沙星诱导后菌株H128,对诺氟沙星和环丙沙星的MIC值增加了1000倍;氨苄青霉素诱导后的菌株A128,对萘啶酸、环丙沙星、诺氟沙星、头孢唑啉的MIC增加了100倍以上;四环素诱导后的菌株S128对四环素的MIC值增加了64倍。8 MIC浓度ε-聚赖氨酸诱导后的菌株ε8,只对四环素、头孢唑啉和阿莫西林三种抗生素产生了耐药性。适应性分析发现诱导耐药菌株的对数生长期延长,但是最终的菌液浓度可以达到或超过始发菌株。耐药稳定性实验发现环丙沙星诱导获得的菌株H32、H128的耐药性比较稳定,而经氨苄青霉素诱导后的耐药菌株A128,对环丙沙星的耐药性在传代过程中出现了回复现象。(2)始发菌株F7的全基因组测序采用单分子PacBio测序,通过各种软件分析,对始发菌株F7的基因功能有了进一步的了解。通过系统发育树分析,发现食品分离株F7与公共数据库中两株临床株的亲缘性最接近。对耐药基因的分析发现,F7中多药外排泵基因共计64个,四环素外排基因8个、β内酰胺酶基因5个、氯霉素耐药基因1个、喹诺酮类抗生素耐药基因1个。对RND型外排泵编码基因进行同源分析,28个相关基因的同源基因都在F7中存在,其中26个同源基因蛋白序列与参考序列的相似性在95%以上。(3)诱导耐药菌株对喹诺酮类药物的抗性机制研究采用PCR技术扩增各系列耐药菌株的gyrA、parC基因的喹诺酮耐药决定区(QRDR),送华大基因测序,并与始发菌株F7以及参考序列进行比对。发现只有H32、H128的gyrA基因发生了Ser83-Ile的突变,而所有菌株的parC基因都没有发生非同义突变。采用反转录荧光定量PCR,以16S rRNA为内参基因,测定了RND型多药外排泵相关基因vmeB、vmeD、vpoC的表达量。发现在H128中,vmeD和vpoC基因表达量相对始发菌株F7上调了9.71倍和3.43倍;在H32、S32、S128中,只有vmeD基因上调了1.5-2.1倍;所有菌株的vmeB基因表达量都低于始发菌株。表明在H128中起主要药物外排作用的是VmeCD-VpoC。