【摘 要】
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本研究通过噬菌体展示的技术构建抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体库,进而构建完整抗体用来诊断和治疗猪流行性腹泻,减少该疫病对养猪业的经济损失,促进其健康发展,具有极为重要的意
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本研究通过噬菌体展示的技术构建抗猪流行性腹泻病毒的单链抗体库,进而构建完整抗体用来诊断和治疗猪流行性腹泻,减少该疫病对养猪业的经济损失,促进其健康发展,具有极为重要的意义,具体内容如下: 试验一抗猪流行性腹泻病毒噬菌体单链抗体库的构建 利用猪流行性腹泻疫苗加强免疫发病耐过的猪群,收集提取外周血淋巴细胞的总RNA,经Random6或特异性引物反转录形成cDNA。从GenBank数据库及IMGT数据库中检索已经登入的猪抗体序列,对其抗体序列进行分析,分析得到序列中的可变区以及恒定区,在高保守区设计引物,得到9条重链引物,6条轻链(Kappa)引物以及5条轻链(Lambda)引物。以反转录的cDNA为模板,扩增猪的重链及轻链可变区,将获得的重链和轻链的扩增片段通过Linker接头连接,克隆到pComb3XSS噬菌体载体质粒中,以构建scFv噬菌体单链抗体文库,并通过PCR和测序的方法鉴定其正确性及多样性,原始库量约为9.5×1010pfu/mL,成功构建了猪源抗猪流行性腹泻病毒的噬菌体单链抗体库。 试验二抗猪流行性腹泻病毒噬菌体单链抗体库的鉴定及筛选 以猪流行性腹泻重组S蛋白为抗原包被96孔酶标板,经过3轮“吸附-洗脱-富集”的筛选过程,将筛选得到的噬菌体重组载体感染感受态XLI-Blue,增殖后涂布于培养基平皿上,挑单个菌落测序,进行序列分析,并通过Phage-ELISA鉴定阳性重组抗体。筛选得到1株与猪流行性腹泻S蛋白结合特异性较高的噬菌体单链抗体。 试验三抗猪流行性腹泻病毒猪源完整抗体的构建及真核表达 将筛选得到的1株与猪流行性腹泻S蛋白结合特异性较高的噬菌体单链抗体进行序列分析,设计引物,扩增出VH区和VL区,与CH区和CL区进行搭桥PCR,扩增出的产物连接表达质粒pCAGGS,转染293T细胞真核表达,进行蛋白纯化。经SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定,表达产物的分子质量约为150KD。为下一步中和试验和动物实验奠定基础,为抗猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体制备提供了理论依据。
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