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乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus,HBV）与HBV相关性肝细胞癌（Heptocellularcacinoma,HCC）的发生、发展密切相关。HBV及其编码的多种病毒蛋白可通过各种途径促进HCC的侵袭转移和血管生成。HBV表面抗原（Hepatitis B virus surface antigen,HBs Ag）是含量最高的病毒蛋白,其包含三种形式,即大蛋白（Large HBs Ag,LHBs）、中蛋白（Medium HBs Ag,MHBs）及小蛋白（Small HBs Ag,SHBs）,其中以SHBs最为丰富。SHBs大量合成并在内质网加工和成熟会引起内质网压力（Endoplasmic reticulum stress,ER stress）,并导致下游信号通路的改变。临床研究表明,血清SHBs>1000 IU/ml患HCC风险提高3.86倍,小鼠实验显示以特异性抗体清除SHBs可以大大降低小鼠患HCC的机率,提示SHBs与HCC发生、发展密切相关。因此,本文旨在研究SHBs通过ER stress对肝癌转移以及血管生成的影响及其具体机制。本研究的第一部分旨在探讨SHBs对肝癌转移及血管生成的影响。首先以重组慢病毒感染并构建稳定表达SHBs-Flag融合蛋白的肝癌细胞株Huh7-SHBs及Hep G2-SHBs（对照细胞Huh7-Flag及Hep G2-Flag）。随后通过划痕实验和Transwell小室（有或无基质胶）实验发现SHBs促进肝癌细胞的迁移及侵袭能力;以裸鼠肝脏原位种植瘤实验发现SHBs促进肝癌细胞的肝内及肺部转移并且缩短裸鼠生存期。此外,以血管内皮细胞成环实验和Transwell小室实验发现表达SHBs的肝癌细胞培养液上清可促进人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs）成环及迁移能力;通过裸鼠皮下荷瘤实验及免疫组化实验发现SHBs促进肿瘤的生长及增加肿瘤微血管密度（Microvascular density,MVD）。进一步通过收集112例肝癌组织,统计并分析临床资料以及病理结果,发现在这些病例中HBs Ag与肝硬化、AFP、肿瘤数目、肿瘤包膜完整性以及TNM分期相关,并且HBs Ag阳性患者术后总生存期短,HBs Ag是肝癌不良预后的独立危险因素。以免疫组化检测发现HBs Ag与肝癌组织中微血管密度呈正相关。以上结果表明SHBs促进肝癌转移及血管生成。本研究第二部分旨在探讨SHBs促进肝癌转移机制。本部分第一章研究SHBs对肝癌细胞上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）的影响,通过Western blot、Real-time PCR或免疫组化检测细胞、荷瘤以及肝癌组织EMT标志蛋白的变化,发现SHBs下调肝癌细胞上皮标志蛋白E-cadherin并上调间质标志蛋白N-cadherin、Vimentin蛋白及m RNA的表达;SHBs下调荷瘤和肝癌组织中E-cadherin蛋白并上调N-cadherin蛋白。以Western blot、Real-time PCR和Luciferase assay检测调控EMT相关的转录因子,发现SHBs增强Snail、Slug、Twist1、ZEB1蛋白、m RNA水平及启动子活性。以上结果表明SHBs促进EMT的发生。本部分第二章研究SHBs调控EMT的机制。以调控EMT通路的各种抑制剂处理SHBs肝癌细胞,通过Western blot及Transwell小室实验检测EMT主要标志蛋白E-cadherin及细胞迁移能力的变化,发现STAT3的抑制剂S3I-201处理细胞后逆转SHBs对E-cadherin及细胞迁移的影响,提示SHBs可能通过STAT3促进EMT和肝癌细胞转移。因此,进一步以针对STAT3的两条si RNA及抑制剂处理SHBs肝癌细胞,通过Western blot、Real-time PCR和Transwell小室实验检测发现si RNA及抑制剂都可逆转SHBs对EMT相关蛋白在蛋白和m RNA水平的影响,并且抑制SHBs促细胞迁移及侵袭能力。此外,构建STAT3敲减的SHBs肝癌细胞株进行裸鼠肝脏原位移植,发现STAT3敲减后移植瘤转移能力明显降低。以上结果表明SHBs通过STAT3途径促进肝癌细胞EMT及肝癌转移。本部分第三章研究SHBs通过JAK2促进STAT3（Tyr705）磷酸化。通过Western blot实验发现SHBs促进STAT3 Tyr705位点磷酸化,但对Ser727位点无影响。进一步通过细胞质、核分离实验和免疫荧光实验发现除了在细胞质之外,SHBs也使细胞核STAT3（Tyr705）磷酸化水平增高。以免疫组化和Western blot检测荷瘤及肝癌组织,发现SHBs促进STAT3（Tyr705）磷酸化。以Western blot实验检测发现SHBs促进JAK2 Tyr1007/1008位点的磷酸化,并通过免疫沉淀（Immunocoprecipitation,IP）实验发现SHBs与STAT3,JAK2无相互作用。进一步以Western blot实验检测,发现JAK2/STAT3的激活与负调控蛋白SOCSs,SHP1/2家族蛋白无关。将JAK2的抑制剂AG490处理细胞,以Western blot、Real-time PCR和Transwell小室实验检测,发现AG490可抑制SHBs对STAT3、EMT相关蛋白在蛋白和m RNA水平的作用,并且抑制SHBs促进细胞迁移及侵袭能力。以上结果表明SHBs通过促进JAK2的磷酸化增强STAT3的磷酸化,最终促进肝癌细胞EMT和迁移侵袭。本部分第四章研究SHBs促进JAK2/STAT3通路的机制。通过细胞因子芯片检测发现SHBs促进成纤维细胞生长因子19（Fibroblast Growth Factor-19,FGF19）的表达,随后以Western blot、Real-time PCR和ELISA进行进一步验证,表明SHBs增强FGF19 m RNA和蛋白水平,但对其受体FGFR4无影响。以针对FGF19和FGFR4的两条si RNA处理SHBs肝癌细胞株,通过Western blot和Transwell实验检测,发现si RNA敲减FGF19或FGFR4后,可抑制SHBs促进JAK2、STAT3的磷酸化及肝癌细胞的迁移侵袭的能力。结果表明SHBs通过增强FGF19的表达促进肝癌转移。然后用ER stress的减轻剂4-PBA、TUDCA及SHBs S204R突变体（促进ER stress的作用较野生型SHBs高）处理细胞,通过Western blot检测,发现4-PBA和TUDCA可抑制SHBs对FGF19增强表达作用,相反,SHBs S204R突变体进一步增强FGF19的表达。以上结果表明SHBs通过ER stress促进FGF19的表达从而激活JAK2/STAT3通路,促进肝癌细胞的迁移、侵袭。本研究第三部分旨在探讨SHBs促进肝癌血管生成的机制。本部分第一章研究SHBs促进血管生成的机制。通过Western blot、Real-time PCR和ELISA检测,发现SHBs增强血管内皮生长因子A（Vascular endothelial growth factor A,VEGFA）的表达,进一步实验发现HBV中SHBs起始密码突变后,减弱1.2倍体HBV增强VEGFA表达的作用。以针对VEGFA的两条si RNA处理SHBs肝癌细胞并以此细胞培养液上清处理HUVECs细胞,发现HUVECs细胞成环及迁移能力减弱。以上结果表明SHBs通过增强VEGFA的表达促进肝癌血管生成。本部分第二章研究SHBs增强VEGFA表达的机制。通过Western blot、血管成环和Transwell小室实验检测,发现ER stress抑制剂4-PBA和TUDCA可抑制SHBs对VEGFA表达的增强作用,并且SHBs G154R突变体进一步增强VEGFA的表达。表明SHBs通过ER stress增强VEGFA的表达。为了更深入探讨SHBs作用于ER stress下游通路的研究,将针对ER stress下游三条通路IRE1、PERK和ATF6的si RNA处理SHBs肝癌细胞,以Western blot、血管成环和Transwell小室实验检测发现三条通路的si RNA都可抑制SHBs增强VEGFA的作用及血管成环和迁移能力。以上结果表明SHBs通过ER stress下游三条通路IRE1-XBP1、PERK-ATF4和ATF6增强VEGFA的表达从而促进血管生成。