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目的:通过对两头尖多糖的提取纯化及指纹图谱和体外抗肿瘤活性研究,对两头尖多糖进行全面质量分析,进一步为两头尖多糖抑制肠癌的物质基础研究及开发与研究提供科学参考。方法:采用水提醇沉法对两头尖多糖进行提取,利用Box-Behnken响应面法优化两头尖多糖提取工艺;采用活性炭脱色法对两头尖多糖进行脱色,利用Box-Behnken响应面法优化两头尖多糖脱色工艺;采用TCA法对两头尖多糖进行脱蛋白,利用Bo x-Behnken响应面法优化两头尖多糖脱蛋白工艺;对12个产地的两头尖多糖的单糖组成进行了研究并建立了两头尖多糖柱前衍生化指纹图谱,运用主成分分析、聚类分析、典型相关分析等数理统计学方法对数据进行简化精准处理,选择具代表性指标评价不同产地两头尖多糖的质量差异。通过CCK8法测定两头尖多糖对肠癌细胞DLD-1增殖的影响、通过流式细胞术检测两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡的影响、AOEB双染色荧光显色法观察不同浓度的两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡的影响、以RT-PCR检测C-myc、Cyclin D1、MMP2、MMP9相关基因mRNA水平变化情况。结果:两头尖多糖的最佳提取工艺为:液料比10:1,提取时间120 min,提取次数2次,在此条件下两头尖多糖提取率为2.04±0.03%;两头尖多糖最佳脱色工艺为:活性炭添加量7.3%,脱色次数3次,脱色温度90℃,在此条件下两头尖多糖脱色率为97.26±0.91%,可将两头尖多糖溶液完全脱色;两头尖多糖最佳脱蛋白工艺为TCA浓度为20%,反应时间19min,脱蛋白温度52℃,在此条件下两头尖多糖脱蛋白率为94.92±1.64%。通过上述方法对两头尖多糖进行纯化,纯化后分析纯度,纯度达90%以上。建立了两头尖多糖柱前衍生化指纹图谱共有模式,标定了10个共有峰,并指认了其中的7个共有峰,分别为D-甘露糖、D-核糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、L-岩藻糖,12个产地两头尖多糖的相似度为0.890~0.978,表明12个产地两头尖多糖的单糖组成成分一致性较好,均有11个单糖组成,但各成分含量存在差异。聚类分析结果当欧氏距离为20时,12个产地两头尖多糖可聚为2类,S1、S4为一类,其余为一类;当欧氏距离为5时,后者又可聚为2类,S5、S6、S11、S12聚为一类,S2、S8、S3、S7、S9、S10聚为一类。表明PCA结果表明,前3个成分的累计贡献率达到87.973%,选择这3个因子即可对两头尖多糖进行综合评价。通过CCK-8法测定两头尖多糖不同药物浓度、不同作用时间对结肠癌DLD-1细胞增殖的影作用研究中,发现随着药物浓度的增加,结肠癌DLD-1细胞抑制率增加(P<0.01)。作用24小时后细胞抑制率达到最大。流式细胞术测定两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡率的影响作用研究中,发现细胞凋亡率随着药物浓度的增加而增加。AO-EB双染色荧光显色法观察到不同浓度的两头尖多糖对肠癌DLD-1细胞凋亡的影响结果为随着药物浓度的增加橙色固缩状的细胞明显增加,细胞凋亡数也随之增加(P<0.01)。RT-PCR检测C-myc、Cyclin D1、MMP-2、β-Catenin相关基因mRNA水平变化情况,与对照组相比,细胞添加五氟尿嘧啶、不同浓度的两头尖多糖溶液后,基因MMP-2、β-catenin、Cyclin D1、C-MYC的相对表达量都有所降低(P<0.01),其中基因MMP-2的相对表达量明显降低(P<0.01)。结论:Box-Behnken响应面法建立的两头尖多糖提取、脱色、脱蛋白工艺实测值与回归模型拟合度较好,可用于两头尖多糖的提取、纯化,将HPLC指纹图谱结合聚类分析、主成分分析进行模式识别对两头尖多糖质量控制是一种有效的评价方法。通过CCK-8法、AO-EB双染色荧光显色法、流式细胞术、RT-PCR检测发现两头尖多糖对结肠癌DLD-1细胞有一定的抑制作用。上述研究成果可为两头尖多糖抗肿瘤活性研究提供可靠的科学参考,为多糖的开发与应用奠定基础。