【摘 要】
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世界能源发展一直处于持续不断的转型和创新的过程,化石能源的日益枯竭,引发了全球能源危机,要求人们寻找新的替代能源。烷烃类化合物是主要化石燃料的成分,也是汽油、柴油和喷气燃料的主要成分,且具有高能量密度、低凝固点以及与现有燃料储存和分配基础设施的兼容性的优势被认为是理想的化石燃料的替代性能源,具有成为为下一代生物燃料的潜力,也称为“第四代”生物燃料。近年来在野生型小球藻NC64A(Chlorella
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世界能源发展一直处于持续不断的转型和创新的过程,化石能源的日益枯竭,引发了全球能源危机,要求人们寻找新的替代能源。烷烃类化合物是主要化石燃料的成分,也是汽油、柴油和喷气燃料的主要成分,且具有高能量密度、低凝固点以及与现有燃料储存和分配基础设施的兼容性的优势被认为是理想的化石燃料的替代性能源,具有成为为下一代生物燃料的潜力,也称为“第四代”生物燃料。近年来在野生型小球藻NC64A(Chlorella variabilis)中发现的脂肪酸光脱羧酶(Fatty Acid Photodecarboxylase,CvFAP)可在蓝光的催化下,将脂肪酸去羧基转化为烷烯烃类物质,可能实现烷烯烃类物质的可再生化,生产可再生能源,有望成为化石能源的重要替代品。利用脂肪酸光脱羧酶催化油脂脱羧制备烷烯烃的方法,自然光供能更加节能环保。酶法制备具有高效性、副产物少、反应条件温和、绿色安全等优点让其具有广泛的发展前景,但是,与之配套的多酶催化体系反而进展缓慢,透光性差,催化效率和转化率低、成本高等顽疾依然难于解决,亟需开发适宜的新型多酶催化体系,满足其工业化需求。因此如何利用新型的反应体系提高酶的催化效率,提升酶的回收率以及降低成本等问题成为了酶法催化的研究热点。本文结合酶级联催化反应技术,在现有的催化体系——三液相的基础上,进一步构建多液相光酶催化体系。对CvFAP催化性能和应用性进行了阐述和验证,并探索了光酶催化法富集鱼油不饱和脂肪酸的可行性。研究内容如下:(1)通过响应面分析和单因素优化对重组后大肠杆菌(BL21(DE3)-p ET28aCvFAP)进行发酵优化,提高CvFAP的产量,通过响应面(RSM)优化确定最佳培养基配比。在优化后的发酵培养基成分和培养条件下,CvFAP的酶活力可以达到2245.81U/L,比起始培养基中的酶CvFAP产酶量提高了54%。(2)在课题组原有的三液相反应体系下,采用复合盐与全细胞催化构建新型的多液相类光酶催化体系,探索烷烯烃化合物的可再生化。结果显示脂肪酶MAS1为30mg/m L、CvFAP为0.2 g/m L、p H=8.5、37°C时,反应12 h后,烷烯烃的产率可达95%以上。同时考察了不同种类油脂在上述条件下的产量,除蓖麻油外,在12 h后基本能实现完全转化(产量率大于95%),最后对体系的微观结构和稳定性进行了探索。(3)最后以脂肪酸光脱羧酶(CvFAP)偶合脂肪酶联用,通过三液相水解鱼油富集多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated Fatty Acid,PUFA),考察双酶级联催化对PUFA的富集效率的影响。结果显示金枪鱼油中PUFA的含量可达65%,鱼油的回收率高达85.38%。最后在最优的条件下分别对CvFAP全细胞和粗酶液进行多批次的回用。经多次回用后,脂肪酶的活性没有明显的下降,其中全细胞经8次回用后,其PUFA的含量还能保持在49%,回收率为70%。
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