以cDNA文库为基础的ESTs(Expressed Sequence Tags,表达序列标签)技术是一种快速地进行基因功能分析及发现新基因的有效方法。为了开展识别和分离开花相关基因研究,本文构建了中棉所36花发育期均一化cDNA文库,并以该文库为材料进行大规模的3’端EST测序和生物信息学分析。本研究获得的主要结果如下:1.采用本实验改良的CTAB法从中36花发育各种形态花器官中提取总RNA,混合后分离纯化富含PolyA的mRNA,经反转录酶反转录合成双链cDNA,利用DSN法对其进行了均一化。均一化之后,通过过柱回收法筛选出其中大于500bp的片段与载体pDNR-LIB连接,最后用电转化法转化宿主菌ElectroMAXDH10B,构建了中棉所36花发育期均一化cDNA初级cDNA文库。经质量检测,高丰度基因被降低,而中丰度和低丰度基因得到了富集,说明均一化效果比较好。初级文库的库容为1.7×10~6个/mL,符合高质量文库的要求。文库的重组率为100％,且插入片段的长度在0.5~3.0 kb之间,说明文库是完整、有效的,可以用于大规模EST序列测定及数据分析。2.从中棉所36花发育期均一化cDNA质粒文库中随机选取3421个克隆进行测序,经Phrad软件进行编辑后,获得长度大于100bp的有效序列为3175条,其序列的平均长度为541bp。3.利用Phrap软件对中36花发育期3175条有效EST序列进行片段重叠群分析和拼接后共获得2906个独立基因,其中包括233个片段重叠群和2673个独立的ESTs。4.在3175条序列中,84.19%的序列是单一序列,约15.65%的序列重复次数在2-5次,仅有1条序列的重复次数是5次。用BLAST方法分析这条高拷贝序列,发现它与核苷酸数据库中的EST有很高的同源性,但其基因产物尚不清楚。同时,文库中用来衡量平衡效果的组成型表达基因(如肌动蛋白(actin)和核糖体蛋白(ribosomal protein)基因的各类亚基)的水平都已经降到3个拷贝以下。表明均一化后高丰度基因所占比例下降,中低丰度基因所占比例增大。表明文库的均一化效果显著。5.所有有效序列与NCBI的核酸数据库进行BLAST比对,有31.42%(913/2906)的序列显示了与己知序列高度的同源性;而与蛋白质数据库进行比对时有26.52%(763/2906)的序列显示了与已知序列的同源性。通过表达序列标签(EST)研究中棉所36花发育期基因表达,发现9条EST与花发育有关MADS-box基因存在高度同源性。6.根据SWISSPORT数据库注释的ACCESSION,将独立基因以Gene Ontology进行功能分类。763个具有同源性匹配的序列(被注释)的基因中,按照GO的分子功能、生物过程和细胞组分分三个不同分类角度分类,把通过BlastX比对获得花发育期有功能描述基因(包括功能确定的及推测功能的)分为16类,根据所参与的细胞过程将其分为16大类:代谢相关基因(23.98%)、翻译相关基因(20.18%)、翻译后剪接相关基因(15.73%)、一般功能预测基因(11.93%)、能量代谢相关基因(6.82%)、转录相关基因(4.06%)、信号转导相关基因(3.67%)、未知功能基因(2.75%)、次生代谢相关基因(2.62%)、核染色质结构相关基因(2.36%)、细胞结构相关基因(1.57%)、细胞内运输相关基因(1.44%)、复制相关基因(1.31%)、细胞骨架相关基因(0.92%)、RNA处理相关基因(0.39%)、细胞抗性及防御相关基因(0.26%)。