【摘 要】
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β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin,β-LG）是引起牛乳过敏的主要成分之一,降低其致敏性对过敏人群来说十分必要。通过PEG修饰降低其致敏性是国际乳制品加工研究的热点。课题组前期针对β-LG不同基团进行PEG修饰的结果表明,不同的结合位点对β-LG结构和抗原性的影响大相径庭。为全面探究不同结合位点及PEG化程度对β-LG抗原性和结构的影响,本课题采用5 kDa的单甲氧基聚乙二醇酰肼（m P
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β-乳球蛋白（β-Lactoglobulin,β-LG）是引起牛乳过敏的主要成分之一,降低其致敏性对过敏人群来说十分必要。通过PEG修饰降低其致敏性是国际乳制品加工研究的热点。课题组前期针对β-LG不同基团进行PEG修饰的结果表明,不同的结合位点对β-LG结构和抗原性的影响大相径庭。为全面探究不同结合位点及PEG化程度对β-LG抗原性和结构的影响,本课题采用5 kDa的单甲氧基聚乙二醇酰肼（m PEG-Hz,5 kDa）对β-LG羧基进行共价修饰,制备出两种PEG化程度的修饰产物,随后对修饰产物进行分离纯化和鉴定,对其结构、抗原性和结合位点进行分析,探究结合位点和PEG化程度对结构和抗原性的影响,初步探讨其抗原性变化机理,为调控β-LG的抗原性提供了理论依据。采用5 kDa的m PEG-Hz对β-LG的羧基进行共价修饰并且对修饰条件进行优化。以修饰率为指标,通过SDS-PAGE及凝胶过滤色谱分析对反应p H、β-LG与PEG摩尔比、β-LG与EDC摩尔比、EDC与sulfo-NHS摩尔比进行优化。结果发现,以上4种因素对修饰率均有较大影响,在p H 4.0、摩尔比β-LG:PEG为1:20、β-LG:EDC为1:50、EDC:sulfo-NHS为5:1的反应条件下,总修饰率最高,为82.91%。采用阳离子交换色谱分离纯化得到两个修饰产物峰,修饰产物的纯度分别为99.66%和98.61%;SDS-PAGE结果表明,纯化收集得到的两种修饰产物表观分子量分别在26-34 kDa和34-43 kDa之间;MALDI-To F-MS结果表明,两种修饰产物的实际分子量分别为23.3 kDa和28.6 kDa,证明所得到的两种产物分别为mono-PEG-β-LG和di-PEG-β-LG。结构分析表明:修饰产物游离巯基含量显著降低,表面疏水性增加,荧光强度降低,三级结构展开;mono-PEG-β-LG的二级结构未发生显著变化,而di-PEG-β-LG的α-螺旋含量降低,无规则卷曲含量升高,二级结构发生显著变化。PEG修饰后β-LG的半抑制浓度（IC50值）由1.90μg/m L分别升高至2.47μg/m L（mono-PEG-β-LG）和10.41μg/m L（di-PEG-β-LG）,抗原性显著降低,且PEG化程度越高,抗原性降低越显著。位点分析结果显示,mono-PEG-β-LG最可能的结合位点为Ile162,di-PEG-β-LG最可能第一个PEG结合在Ile162上,第二个PEG结合在Asp127、Glu130和Glu134的其中之一上。PEG共价修饰β-LG羧基可以显著降低后者的抗原性,PEG分子的遮蔽作用和β-LG空间结构改变导致的构象表位破坏是修饰产物抗原性降低的原因,且PEG化程度越高,遮蔽作用和构象表位破坏越明显,抗原性越低。结合前期研究可以发现,PEG分子的结合位点和PEG化程度对β-LG的抗原性均有极大影响。
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