【摘 要】
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本文优化了植物螯合肽的提取方法,研究刚毛藻植物螯合肽对铅胁迫的亚细胞响应,研究了不同Pb2+胁迫浓度(0、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0mg/L)下Pb2+在刚毛藻植物螯合肽中的分布。探讨了刚毛藻中非蛋白质态巯基总量(NPT),谷胱甘肽(GSH),植物螯合肽(PCs)对Pb2+的吸收情况,分析了Pb2+在刚毛藻植物螯合肽中的吸收浓度及在刚毛藻Pb吸收中的占比。通过FTIR并拟合出
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本文优化了植物螯合肽的提取方法,研究刚毛藻植物螯合肽对铅胁迫的亚细胞响应,研究了不同Pb2+胁迫浓度(0、0.5、1.0、2.5、5.0、7.5、10.0mg/L)下Pb2+在刚毛藻植物螯合肽中的分布。探讨了刚毛藻中非蛋白质态巯基总量(NPT),谷胱甘肽(GSH),植物螯合肽(PCs)对Pb2+的吸收情况,分析了Pb2+在刚毛藻植物螯合肽中的吸收浓度及在刚毛藻Pb吸收中的占比。通过FTIR并拟合出蛋白质二级结构模型,XPS,XRD,以及Zeta电位技术对刚毛藻植物螯合肽进行表征,解析植物螯合肽在Pb解毒中发挥的作用,厘清其解毒机制。主要研究结论如下:(1)在优化植物螯合肽提取法中:料液比为1:3时GSH提取量的浓度较大,为3.455mmol/L;在浸提温度为60℃时GSH提取量的浓度较大,为3.327mmol/L;在料液比为1:4时NPT的提取量浓度较大,为4.439mmol/L,在浸提温度为40℃时NPT的提取量浓度较大为4.311mmol/L;在浸提时间为60min时GSH、NPT提取量的浓度较大,分别为3.542mmol/L和4.631mmol/L。(2)高浓度铅处理,造成了刚毛藻中植物螯合肽含量显著增高,特别是当胁迫浓度达5.0 mg/L。细胞壁和细胞液中的植物螯合肽,对Pb的解毒起了主要作用,较GSH和PCs,NPT在刚毛藻细胞壁中所起的解毒效果更大,而PCs则是刚毛藻细胞器的主要解毒机制。Pb2+胁迫初期(1d),NPT和PCs已发生显著变化,随着Pb胁迫时间的延长,刚毛藻植物螯合肽中GSH逐渐发挥其解毒作用。(3)植物螯合肽在刚毛藻Pb2+吸收中发挥一定作用。随着Pb浓度的增大,植物螯合肽中Pb2+含量逐渐增大。在供试浓度范围内,在铅胁迫浓度为2.5mg/L时,刚毛藻NPT中的铅占比达到最大占比为11%,达到最大占比后,继续加大铅胁迫浓度,NPT中铅占比呈现上下震荡的趋势。刚毛藻GSH中的铅含量占比随着铅胁迫浓度的增大而逐渐上升,当铅胁迫浓度为7.5mg/L时达到最大为10%,随后继续加大铅胁迫浓度,刚毛藻GSH中的铅含量占比下降至8%。PCs的铅含量占比随着铅浓度增大而增大。在低浓度下缓慢增大,在铅浓度达到5mg/L时其铅占比显著增大。(4)通过FTIR研究了Pb在刚毛藻中的解毒作用,在Pb胁迫下,NPT与重金属离子螯合形成的O–Pb–OH、C–O–Pb的结构,GSH中形成了COO–Pb,Pb–S等复合物。刚毛藻在Pb胁迫下,其细胞体内会产生了更多的植物螯合肽(NPT、GSH、PCs),这些蛋白质会与重金属离子结合形成复合物进行解毒。植物螯合肽通过形成的COO–Pb,O–Pb,Pb–S等配合物在来缓解细胞内重金属的浓度。大量的Pb2+较高Pb2+浓度下与植物螯合肽复合形成Pb–C–N。(5)XPS结果显示在Pb2+胁迫下,NPT中的含N基团与铅离子结合形成带有Pb–N结构的复合物,其中巯基与铅离结合形成Pb–C–S的结构。当铅离子的浓度增大时,Pb2+会与NPT螯合并形成C=O–Pb的复合物。铅离子同样会与GSH中的巯基形成螯合物质。当在高浓度Pb胁迫时,铅离子与NPT(PCs)、GSH螯合,形成带有Pb–S基团的螯合物。在研究中还发现刚毛藻中的NPT(PCs)、GSH中存在大量的Pb–N–结构。总之,刚毛藻植物螯合肽会与Pb2+形成带有Pb–N,Pb–C–S,C=O–Pb,Pb–S的螯合物进行Pb解毒。(6)XRD表明在加入Pb2+后,刚毛藻中NPT的衍射峰变窄,在2θ=12.7°,2θ=22.4°的衍射峰随着Pb2+浓度的衍射峰宽带增大,而且在1.0mg/L时,刚毛藻中NPT也没有出现新的衍射峰。2θ=24.6°,2θ=28.6°衍射峰宽带增大,同样也没有生成新的衍射峰。由此可见Pb进入细胞后与NPT,GSH螯合形成的一些络合物,并没有生成沉淀。在5.0mg/L时,植物螯合肽2θ=18.1°,2θ=27.1°出现强峰,NPT中形成了C6H3N3O9Pb,GSH中形成了C12H22O4Pb。
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