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近年来，由食品中化学有害物引发的食品安全问题尤为严重。加强食品安全检测已成为控制污染食品进入市场、保障消费者安全的重要手段之一。当前，食品中化学有害物的检测主要以基于色谱技术及色谱与质谱联用技术的仪器检测方法为主。仪器法检测虽然准确、可靠，但是需要昂贵的设备、专业的操作人员及复杂的样品前处理、检测成本很高，无法满足大批量样品现场检测的需求。以抗原-抗体特异性反应为基础的免疫检测技术具有分析时间短、操作便捷、灵敏高、特异性好、通量高、检测成本低等优势，十分符合我国农产品及食品生产经营分散、量大面广的特点。然而，大量试验结果表明：当化合物的相对分子质量<300 Da时，想要获得其特异性的高亲和力抗体难度逐渐增大；而当半抗原分子量<150 Da（在本论文中定义为“超小分子半抗原”）时，即使偶联到载体蛋白上也难以有效引起动物免疫应答，因而其高亲和力抗体几乎无法获得，至今对其进行直接免疫检测未能突破。然而与此同时，食品中存在着许多“超小分子化学有害物”，比如在食品加工过程中自发产生的内源性有害物丙烯酰胺、氯丙醇、氨基甲酸乙酯、组胺等。这些超小分子化合物一般都具有潜在的毒性、致癌性或致畸性，给人们的身体健康构成极大威胁。因此，突破“抗‘超小分子化合物’的高亲和力抗体制备困难”的技术瓶颈，建立其快速免疫分析方法并进行筛查应用具有重要的理论和现实意义。
本论文以食品加工中产生的三种典型的超小分子化学污染物组胺、氨基甲酸乙酯与丙烯酰胺为研究对象，通过大量设计半抗原及动物免疫制备其特异性抗体，分析半抗原与抗体之间的构效关系，并在获得特异性抗体的基础上建立相应的快速免疫分析方法，在实际样品中进行应用。主要研究内容与成果如下：
（1）提出一种可提升超小分子化合物特异性抗体制备效果的半抗原设计策略
针对组胺等三种超小分子有害物设计了14种不同类型的半抗原，并进行半抗原与抗体构效关系分析，发现了一种可以显著提升超小分子化合物特异性抗体制备效果的半抗原设计策略，即在最大程度保留超小分子化合物特征结构的前提下，引入含单个苯环结构的手臂，提高半抗原诱导动物免疫系统针对半抗原部分产生的免疫应答的能力，进而提升抗体效价。同时，在包被半抗原设计时，应在最大程度保留超小分子化合物特征结构的前体下，引入尽量不含苯环结构的手臂以构建手臂异构的异源包被抗原，以消除抗体对手臂中苯环结构的识别，以此建立竞争免疫分析方法时，可以显著提高抗体对超小分子化合物的检测灵敏度。基于此策略，本研究分别成功制备了特异性识别组胺、氨基甲酸乙酯和丙烯酰胺的多克隆抗体。基于这三个抗体分别建立相应的间接竞争ELISA方法，检测的IC50分别为0.55μg/mL、356.8μg/mL、476.3μg/mL。其中，组胺抗体的性能已能满足实际检测需求
（2）建立了基于单克隆抗体和纳米酶相结合的组胺酶联免疫分析方法
基于杂交瘤筛选技术筛选到一株稳定产抗组胺特异性抗体的杂交瘤细胞（3E9），并制备了组胺单克隆抗体（ZA-mAb）。并合成了稳定性比HRP更好、催化活性极高的类酶纳米材料Pt-Au双金属纳米颗粒。将其代替传统ELISA所用的HRP，建立基于Pt-Au纳米颗粒的dc-ELISA快速定量测定组胺的方法，分析时间仅需55 min。该方法用于鱼肉及红酒样品，检测限分别可以达到3.6 mg/kg与0.91 mg/L，回收率在80.0%~104.0%之间，变异性系数均低于20%，检测结果与LC-MS/MS的相关性好（R2=0.982）。
（3）研制了组胺胶体金免疫层析试纸条
开发了基于组胺特异性单克隆抗体(ZA-mAb)的组胺胶体金免疫层析试纸条。优化了金标抗体的标记条件以及考察了金标抗体浓度、T线包被原浓度、层析时间对试纸条检测性能的影响。最优条件下，该试纸条对鱼肉样品中组胺检测限为11.1 mg/kg，满足鱼肉中组胺的限量要求（50~100 mg/kg），检测时间仅需7 min，非常适合对组胺进行现场快速检测。
（4）建立了基于快速衍生间接检测氨基甲酸乙酯的酶联免疫分析方法
尽管本研究制备获得的抗体可以特异性识别氨基甲酸乙酯（EC），但其灵敏度仍然满足不了检测要求。因此，利用EC可以和占吨氢醇室温下快速反应生成占吨聚氨基甲酸乙酯（XEC）的特点，设计了针对 XEC的两种半抗原，制备了特异性识别XEC多克隆抗体，通过对衍生条件的优化，XEC的衍生反应在室温下仅需5 min，最终建立了通过检测XEC而实现对EC快速检测的ELISA方法。将该方法适用于黄酒样品检测，检测限为0.166 mg/L,回收率在84.4%~100.9%，变异系数在8.2%~9.5%之间。
（5）建立了基于硅量子增敏的检测氨基甲酸乙酯的比率荧光免疫分析
为了进一步提高EC检测方法的灵敏度，在获得多克隆抗体的基础上进一步制备了亲和力更高的抗XEC的单克隆抗体（XEC-mAb）。同时，采用水热法合成了一种水溶性的硅量子点，构建了基于硅量子点的可高灵敏检测HRP的比率荧光传感体系，并将其与传统ELISA平台结合，建立的比率荧光免疫分析方法，实现对EC进行高灵敏检测，用于检测检测红酒样品，检测限为2.6μg/L，平均回收率86.0%~102.7%，变异系数小于13.6%。该方法特别适合用于氨基甲酸乙酯限量严格的食品基质如红酒、酱油等的检测。
（6）建立了基于衍生间接检测丙烯酰胺的酶联免疫分析方法
在前期采用苯硫酚结构的衍生剂与丙烯酰胺衍生策略存在衍生反应时间长需要加热等问题的基础上，改进了丙烯酰胺衍生物制备的问题，利用丙烯酰胺可以与占吨氢醇室温下快速反应生成占吨聚丙烯酰胺（XAA）的特点，针对XAA设计了两种半抗原，制备了特异性识别占吨聚丙烯酰胺的多克隆抗体，并建立基于快速衍生策略，检测丙烯酰胺的ELISA方法，丙烯酰胺的衍生室温仅需30 min。该方法用于饮用水及薯片样品检测，检测限分别为7.9μg/L、7.9μg/kg，回收率在83.6%~99.2%之间，变异系数在10.1%~12.3%之间。
本论文以食品加工中产生的三种典型的超小分子化学污染物组胺、氨基甲酸乙酯与丙烯酰胺为研究对象，通过大量设计半抗原及动物免疫制备其特异性抗体，分析半抗原与抗体之间的构效关系，并在获得特异性抗体的基础上建立相应的快速免疫分析方法，在实际样品中进行应用。主要研究内容与成果如下：
（1）提出一种可提升超小分子化合物特异性抗体制备效果的半抗原设计策略
针对组胺等三种超小分子有害物设计了14种不同类型的半抗原，并进行半抗原与抗体构效关系分析，发现了一种可以显著提升超小分子化合物特异性抗体制备效果的半抗原设计策略，即在最大程度保留超小分子化合物特征结构的前提下，引入含单个苯环结构的手臂，提高半抗原诱导动物免疫系统针对半抗原部分产生的免疫应答的能力，进而提升抗体效价。同时，在包被半抗原设计时，应在最大程度保留超小分子化合物特征结构的前体下，引入尽量不含苯环结构的手臂以构建手臂异构的异源包被抗原，以消除抗体对手臂中苯环结构的识别，以此建立竞争免疫分析方法时，可以显著提高抗体对超小分子化合物的检测灵敏度。基于此策略，本研究分别成功制备了特异性识别组胺、氨基甲酸乙酯和丙烯酰胺的多克隆抗体。基于这三个抗体分别建立相应的间接竞争ELISA方法，检测的IC50分别为0.55μg/mL、356.8μg/mL、476.3μg/mL。其中，组胺抗体的性能已能满足实际检测需求
（2）建立了基于单克隆抗体和纳米酶相结合的组胺酶联免疫分析方法
基于杂交瘤筛选技术筛选到一株稳定产抗组胺特异性抗体的杂交瘤细胞（3E9），并制备了组胺单克隆抗体（ZA-mAb）。并合成了稳定性比HRP更好、催化活性极高的类酶纳米材料Pt-Au双金属纳米颗粒。将其代替传统ELISA所用的HRP，建立基于Pt-Au纳米颗粒的dc-ELISA快速定量测定组胺的方法，分析时间仅需55 min。该方法用于鱼肉及红酒样品，检测限分别可以达到3.6 mg/kg与0.91 mg/L，回收率在80.0%~104.0%之间，变异性系数均低于20%，检测结果与LC-MS/MS的相关性好（R2=0.982）。
（3）研制了组胺胶体金免疫层析试纸条
开发了基于组胺特异性单克隆抗体(ZA-mAb)的组胺胶体金免疫层析试纸条。优化了金标抗体的标记条件以及考察了金标抗体浓度、T线包被原浓度、层析时间对试纸条检测性能的影响。最优条件下，该试纸条对鱼肉样品中组胺检测限为11.1 mg/kg，满足鱼肉中组胺的限量要求（50~100 mg/kg），检测时间仅需7 min，非常适合对组胺进行现场快速检测。
（4）建立了基于快速衍生间接检测氨基甲酸乙酯的酶联免疫分析方法
尽管本研究制备获得的抗体可以特异性识别氨基甲酸乙酯（EC），但其灵敏度仍然满足不了检测要求。因此，利用EC可以和占吨氢醇室温下快速反应生成占吨聚氨基甲酸乙酯（XEC）的特点，设计了针对 XEC的两种半抗原，制备了特异性识别XEC多克隆抗体，通过对衍生条件的优化，XEC的衍生反应在室温下仅需5 min，最终建立了通过检测XEC而实现对EC快速检测的ELISA方法。将该方法适用于黄酒样品检测，检测限为0.166 mg/L,回收率在84.4%~100.9%，变异系数在8.2%~9.5%之间。
（5）建立了基于硅量子增敏的检测氨基甲酸乙酯的比率荧光免疫分析
为了进一步提高EC检测方法的灵敏度，在获得多克隆抗体的基础上进一步制备了亲和力更高的抗XEC的单克隆抗体（XEC-mAb）。同时，采用水热法合成了一种水溶性的硅量子点，构建了基于硅量子点的可高灵敏检测HRP的比率荧光传感体系，并将其与传统ELISA平台结合，建立的比率荧光免疫分析方法，实现对EC进行高灵敏检测，用于检测检测红酒样品，检测限为2.6μg/L，平均回收率86.0%~102.7%，变异系数小于13.6%。该方法特别适合用于氨基甲酸乙酯限量严格的食品基质如红酒、酱油等的检测。
（6）建立了基于衍生间接检测丙烯酰胺的酶联免疫分析方法
在前期采用苯硫酚结构的衍生剂与丙烯酰胺衍生策略存在衍生反应时间长需要加热等问题的基础上，改进了丙烯酰胺衍生物制备的问题，利用丙烯酰胺可以与占吨氢醇室温下快速反应生成占吨聚丙烯酰胺（XAA）的特点，针对XAA设计了两种半抗原，制备了特异性识别占吨聚丙烯酰胺的多克隆抗体，并建立基于快速衍生策略，检测丙烯酰胺的ELISA方法，丙烯酰胺的衍生室温仅需30 min。该方法用于饮用水及薯片样品检测，检测限分别为7.9μg/L、7.9μg/kg，回收率在83.6%~99.2%之间，变异系数在10.1%~12.3%之间。