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研究背景骨质疏松症（osteoporosis,OP）是一种以骨量丢失和骨微结构破坏为特征的全身代谢性骨病,骨形成不足是导致骨质疏松性骨缺损不愈合的最直接原因。线粒体是细胞内的能量代谢中心,在骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs）的成骨分化过程中扮演着重要角色,同时参与细胞内氧化还原稳态的调控,是BMMSCs成骨分化的重要参与者。前期研究指出,雌激素缺乏导致骨质疏松症,发现BMMSCs的骨形成能力和抗氧化功能显著下降。褪黑素（melatonin,MT）是一种松果体产生的神经内分泌激素,已被证实具有改善由雌激素缺乏诱导的骨质疏松症的效果。然而褪黑素对骨质疏松性骨缺损的修复作用是否涉及BMMSCs的线粒体功能调控及其具体机制尚未明确。研究目的研究褪黑素在骨质疏松大鼠来源的BMMSCs线粒体功能调控中的作用,阐明缓释褪黑素的丝素蛋白支架对骨质疏松性骨缺损修复的促进作用,揭示沉默信息调节因子1（silent information regulator type 1,SIRT1）信号分子在调控干细胞线粒体功能和维持能量代谢中的重要机制。研究方法（1）取20只8周龄雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠,随机分为假手术组（Sham组）和卵巢去势组（OVX组）,每组10只。OVX组通过双侧卵巢去势手术构建雌激素缺乏诱导的骨质疏松模型,Sham组进行相同手术操作但不作卵巢切除。术后3个月,分别从Sham组和OVX组大鼠股骨中提取BMMSCs,通过流式细胞仪、透射电子显微镜、ATP检测试剂盒、qRT-PCR和Western Blot,比较两组BMMSCs在线粒体活性氧（reactive oxygen species,ROS）、线粒体功能及抗氧化能力、成骨分化能力方面的差异。（2）使用0.01 μM、1 μM、100 μM梯度浓度褪黑素对OVX组大鼠来源BMMSCs进行干预,通过MitoSOX Red线粒体特异性荧光探针检测线粒体ROS水平,透射电子显微镜观察线粒体形态,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位水平,ATP检测试剂盒检测线粒体腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate,ATP）产量。通过qRT-PCR和Western Blot检测呼吸链复合体关键因子、SIRT1和超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase2,SOD2）的表达水平。茜素红染色检测细胞外基质矿化水平,qRT-PCR检测成骨特定基因的表达水平。分析褪黑素对OVX组大鼠来源BMMSCs线粒体ROS、线粒体功能及抗氧化能力、成骨分化能力的保护作用。（3）低温盐浴法制备负载褪黑素（MT）的丝素蛋白（silk fibroin,SF）支架,并对该支架的药物缓释能力和生物相容性进行检测。取60只8周龄的雌性SD大鼠,随机分为6组,每组10只。分别为Sham组、Sham+SF组、Sham+SF+MT组、OVX组、OVX+SF组、OVX+SF+MT组。在大鼠股骨髁造直径3 mm,深度5 mm的股骨髁缺损模型。其中OVX组、OVX+SF组、OVX+SF+MT组均行卵巢去势手术构建骨质疏松大鼠模型,Sham组、Sham+SF组、Sham+SF+MT组均行假手术。Sham组和OVX组不放支架,Sham+SF组和OVX+SF组植入丝素蛋白支架,Sham+SF+MT组和OVX+SF+MT组植入负载褪黑素的丝素蛋白支架。术后8周,分离大鼠股骨,通过Micro-CT与三维重建分析对股骨髁骨缺损部位进行检测分析,用骨密度和骨体积比评价褪黑素体内缓释对于大鼠股骨缺损部位修复的效果。苏木素-伊红染色观察骨小梁微结构。（4）使用小干扰RNA沉默Sirt1基因的表达,qRT-PCR和Western Blot检测SIRT1及下游抗氧化酶SOD2的表达水平,再一次对线粒体ROS、线粒体功能、呼吸链复合体关键因子和BMMSCs成骨分化能力进行检测,明确SIRT1在褪黑素调控线粒体功能中的作用。研究结果（1）与Sham组相比,OVX组大鼠来源的BMMSCs线粒体内存在高水平氧化应激,线粒体功能及抗氧化能力受损,成骨分化能力下降。（2）褪黑素以剂量依赖的方式缓解OVX组大鼠来源的BMMSCs线粒体内氧化应激水平,提高线粒体功能,表现为线粒体ROS下降了 35.3%,线粒体膜电位和ATP产量上升,呼吸链复合体关键因子表达上调。褪黑素干预提升线粒体抗氧化能力,表现为SIRT1和SOD2的蛋白表达分别上调1.2倍和1.8倍。褪黑素恢复骨质疏松大鼠来源BMMSCs的成骨分化能力,细胞外基质矿化水平提升了 4.8倍,成骨特定基因表达上调。（3）负载褪黑素的丝素蛋白支架能够对OVX大鼠股骨髁骨缺损有效修复,Micro-CT及三维重建结果显示植入负载褪黑素的丝素蛋白支架的OVX大鼠股骨缺损部位骨密度和骨体积分数分别增加了 1.0倍和1.4倍,组织形态学分析发现褪黑素体内缓释保护了 OVX组大鼠的骨小梁结构。（4）沉默Sirt1后,Sirt1的mRNA表达下降了 53.9%。褪黑素对骨质疏松大鼠来源BMMSCs的线粒体功能及成骨分化能力的保护作用减弱,表现为膜电位和ATP产量下降、抗氧化酶SOD2和呼吸链复合体关键因子表达下调、细胞外基质矿化水平下降了 81.1%、成骨特定基因表达下调。研究结论（1）骨质疏松大鼠来源BMMSCs线粒体功能受损,成骨分化能力显著下降。（2）褪黑素减轻骨质疏松大鼠来源BMMSCs线粒体氧化应激损伤,保护线粒体功能,促进其成骨分化能力。（3）负载褪黑素的丝素蛋白支架促进骨质疏松大鼠股骨髁骨缺损的修复。（4）沉默SIRT1抵消褪黑素对骨质疏松大鼠来源BMMSCs线粒体功能的保护作用和成骨分化能力的促进作用。