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目的:观察实验性大鼠正常组、肝纤维化模型组、应用自拟中药干预组,骨髓间充质干细胞(MSCs)体外诱导分化为类肝细胞的差异,同时研究含不同浓度血清及细胞诱导因子的培养液对细胞诱导分化的影响。旨在探讨MSCs体外培养、诱导的最优条件,为MSCs治疗临床重症肝病患者提供参考依据。
方法:Wistar大鼠24只,随机分为3组,每组8只,雌雄各半。分别为正常对照组、肝纤维化模型组、自拟中药干预组。采用CCl<,4>乳剂皮下注射建立肝纤维化模型。造模成功后自拟中药干预组采用丹金舒肝胶囊药液灌胃治疗,肝纤维化模型组、正常对照组每天给予等量蒸馏水灌胃。共治疗42d。治疗结束后剖杀大鼠,留取大鼠肝脏标本,HE 染色观察各组病理改变。同时采用密度梯度离心法和贴壁法分离各组大鼠的MSCs,应用低糖DMEM完全培养基(含20%胎牛血清、青霉素100mg/L、链霉素100mg/L),置37℃、5%CO<,2>、饱和湿度的CO<,2>培养箱中分组培养。在细胞接近90%汇合时进行传代,传至第3代时,得到纯化的MSCs。采用析因试验,设不同诱导时间、不同浓度的胎牛血清、不同浓度的细胞因子为3个因素,每个因素设不同水平,对各组纯化的MSCs进行分组诱导培养。留取15、21、27 d细胞培养液进行白蛋白(Alb)、甲胎蛋白(AFP)检测;于27d时收集细胞爬片,采用过碘酸希夫(PAS)实验进行糖原染色和免疫细胞化学染色检测MSCs中CK-18、CK-19。
结论:
①HGF、FGF-4可在体外诱导实验性大鼠的MSCs分化为具有肝细胞样细胞表型和功能的类肝细胞;
②不同浓度的胎牛血清和HGF、FGF-4影响MSCs的体外分化;
③自体MSCs可以作为治疗临床重症肝病的一种细胞来源,而临床联合中药复方治疗可能会使MSCs体外诱导的效果更为理想。