论文部分内容阅读
禽致病性大肠杆菌（Avian pathogenic Escherichia coli,APEC）可以引起鸡、鸭、鹅等禽类发生严重的呼吸系统疾病,造成世界范围内家禽的高死亡率,从而为养禽业带来巨大经济损失。研究发现APEC具有复杂的致病机制,其在感染过程中可以释放包裹有蛋白质、核酸、脂质及各种其他毒力因子的外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles,OMVs）促进其致病力。现阶段研究发现,其他革兰氏阴性菌分泌产生的OMVs不仅可以通过内化方式进入宿主细胞引起炎症反应,而且能够突破机体防御屏障结构引起宿主感染,增强源细菌的致病力。本文作者所在团队前期研究发现禽致病性大肠杆菌外膜囊泡（APEC-OMVs）能够诱导宿主细胞鸡气管黏膜上皮细胞（Chicken Tracheal Epithelial Cells,CTECs）凋亡且具有体内致病功能,但是其进入CTECs的内吞方式不清楚、同时APEC-OMVs在宿主体内的运动轨迹及致细胞病理变化有待进一步研究。针对上述问题,本研究拟先荧光标记APEC-OMVs,在应用不同的细胞内吞抑制剂提前处理CTECs,通过该方法探究APEC-OMVs进入CTECs的内吞方式;建立核素标记APEC-OMVs示踪的方法,监测其在SPF雏鸡体内的运行轨迹,探究APEC-OMVs在宿主体内的运行轨迹和组织分布及其致细胞病理变化。主要研究方法和结果分析如下:（1）APEC-OMVs的提取纯化鉴定及方法改良使用超高速离心法粗提APEC-OMVs后利用密度梯度离心法对粗提物进一步纯化,结合免疫印迹法（Western blotting,WB）分析密度梯度离心后APEC-OMVs富集于Opti Prep?密度梯度培养基的浓度区间。采用透射电镜对纯化后APEC-OMVs进行鉴定,并用BCA法测定其浓度。结果显示:粗提的APEC-OMVs经密度梯度梯度离心后主要位于30-40%Opti Prep?密度梯度培养基层;APEC-OMVs大多呈球囊状,具有双层囊状结构;按照本研究改良的提取纯化方法提取的APEC-OMVs浓度约为300μg/m L,较之前文献的传统提取方法提取的APEC-OMVs浓度和纯度有了明显的提升。（2）APEC-OMVs进入CTECs的内化方式本试验DIO标记APEC-OMVs,分别使用氯丙嗪（Chlorpromazine,CPZ）、PMA（Phorbol 12-myristate 13-acetate）、dynasore、甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin,MβCD）、细胞松弛素D（cytochalasin D,Cyt D）以及盐酸阿米洛利（Amiloride HCl dihydrate,EIPA）对CTECs的各种内吞途径进行抑制,同时结合CCK8试剂盒研究各类内吞途径抑制剂的最高抑制浓度。然后使用DIO染料标记APEC-OMVs后与最高抑制浓度的内吞途径抑制剂处理的CTECs共培养24 h,荧光显微镜观察不同内吞途径抑制剂处理的CTECs摄取APEC-OMVs的情况。结果显示:经CPZ、PMA、dynasore和MβCD处理后的CTECs摄取APEC-OMVs的含量较没有药物处理的CTECs摄取的含量差异不显著,而EIPA和Cyt D处理后的CTECs摄取APEC-OMVs含量显著降低。上述实验结果表明APEC-OMVs主要通过巨胞饮内吞方式进入CTECs。（3）APEC-OMVs感染SPF雏鸡的体内运行轨迹和组织分布本试验采用89Zr对APEC-OMVs标记,结合Radio-i TLC对89Zr的标记效率、放化纯度和体外稳定性进行检测,确定89Zr成功标记APEC-OMVs。将标记成功的APEC-OMVs记为89Zr-DFO-APEC-OMVs。89Zr-DFO-APEC-OMVs气管注射SPF雏鸡后使用micro-PET显像仪实时观察其在雏鸡体内的运行轨迹和组织分布。显像完成后收集雏鸡主要器官（肺、胃、肠等）,制作病理组织学切片观察感染器官的病理变化。Radio-i TLC实验结果显示89Zr-DFO-APEC-OMVs的标记效率为90.23±3.88%,放化纯度＞98%,在120 h内稳定性良好,将稳定的89Zr-DFO-APEC-OMVs用于体内失踪实验。Micro-PET显像结果显示89Zr-DFO-APEC-OMVs被雏鸡摄取后在肺、胃和肠中摄取较高,且在36 h后可从雏鸡体内代谢完毕。病理切片结果显示肺、胃和肠发生了严重的病理变化,伴有炎性细胞浸润,其中以巨噬细胞为主,含有少数淋巴细胞和浆细胞。同时脑的病理切片呈现的袖套现象说明APEC-OMVs不具有突破血脑屏障的能力。上述实验表明APEC-OMVs感染雏鸡后呈全身性分布且主要分布于肺、胃和肠。综上所述,本研究成功对APEC-OMVs的提取方法进行了改良,提高了APEC-OMVs的提取纯度,发现其主要通过巨胞饮内吞途径进入CTECs。同时,本研究首次建立了89Zr标记APEC-OMVs在SPF雏鸡的体内示踪方法,发现APEC-OMVs在被SPF雏鸡摄取后主要分布于肺、胃和肠且不具有突破血脑屏障的能力。这一研究对揭示APEC-OMVs的致病机制提供了重要参考。