萌芽豇豆富集γ-氨基丁酸的特性、工艺及其合成酶酶学性质研究

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Y-氨基丁酸(γ-Amino butyric acid或γ-Aminobutanoic,简称GABA),又称氨酪酸,是一种天然存在的非蛋白质氨基酸。GABA是哺乳动物中枢神经系统中重要的抑制性神经递质,参与脑循环生理活动,具有降压、改善脑机能、增强记忆、抗焦虑等生理功能,是医药食品中的一种重要的功能因子。自然界中GABA分布非常广泛,在动物、植物和微生物中均有存在。本文主要对高GABA含量豆类的筛选、GABA测定方法、豇豆萌芽过程中GABA的富集和豇豆中的谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)的部分性质进行了初步的研究。结果如下:1、选择了大豆(中黄13、黑豆)、豇豆(宁豇3号)、红豆、绿豆、鹰嘴豆(北园春、阿瓦提)为实验材料。测定了发芽后的GABA及种子中全氨基酸的含量,研究了GABA含量与豆类种子中含氮化合物的相关性。结果表明:在相同处理条件下,萌芽豇豆中GABA含量最高,达到131.36 mg/100g。发芽豆类中GABA的含量与豆类种子中的谷氨酸含量的相关性达极显著水平,与必需氨基酸存在显著相关性。2、研究了高效液相法、纸层析法和比色法测定GABA,确定了高效液相的测定条件为:A:B=72:28;流动相A:醋酸钠20 mmo1/L,pH 6.34;流动相B:甲醇100%;流速:0.8 ml/min;进样量20 gm。检测波长:338 nm;柱温:40℃,此法相对偏差为1.06%,检出限为5 mg/100g,回收率在93.2%-105%之间。纸层析法和比色法的测定结果相对普遍偏低。3、通过单因素及响应面试验研究了浸泡温度和时间,发芽温度和时间等因素对GABA积累量的影响,确定了豇豆最佳发芽工艺参数为:在浸泡温度34℃,浸泡时间25 h,发芽温度33℃和发芽时间24 h的条件下,豇豆中GABA的含量达到203.53mg/100g,是未发芽豇豆中GABA的7.48倍。豇豆在发芽过程中营养成分发生了变化,随发芽时间的延长,总糖大幅减少、总蛋白质含量略有减少。还原糖和游离氨基酸都有明显的增加。4、研究了萌芽时间、温度以及不同浸泡液对萌芽豇豆GABA含量的影响,在30℃下,萌发24小时的豇豆GABA含量高达81.5 mg/100g,较萌发前高15.8 mg/100g。在浸泡液pH为4时,萌芽豇豆GABA含量可达233.09 mg/100g,为萌发前豇豆GABA含量的4倍左右。Ca2+浓度在0.1 mmol/L时,GABA含量可高达88.6 mg/100g,继续增加Ca2+浓度,则GABA含量降低。磷酸吡哆醛(PLP)浸泡液浓度在4 mmol/L时,萌芽豇豆GABA的含量可达84.3 1 mg/100g,较萌发前提高了20%左右。VB6浸泡液在1 mmol/L时,萌芽豇豆GABA含量为96.66 mg/100g,是萌芽前豇豆GABA含量的1.5倍左右。NaCl和L-Glu浸泡液不能起到促进萌发豇豆富集GABA的作用。正交试验结果表明:影响豇豆中GABA的因素主次顺序为:pH>VB6>浸泡时间>萌芽时间。最佳富集工艺为浸泡20小时,萌芽12小时,pH4,VB6浓度为1.5 mmol/L,得到GABA含量为254.48 mg/100g。方差分析结果表明:浸泡时间和pH对豇豆中GABA含量的影响是显著的(p<0.05)。5、研究了谷氨酸脱羧酶的部分酶学性质。结果表明:豇豆的GAD最适反应温度是40℃,与底物L-Glu最适反应的pH是5,最佳反应时间是20 min。豇豆的GAD热稳定性较差,50℃下保温1h后,酶活下降至55%左右,而70℃时下降至10%左右。在80℃就完全失活。在pH4-5.5范围内能保持80%以上的酶活。豇豆GAD对底物和辅酶PLP的Km分别为23.38 mmo1/L和18.62μmol/L。离子Mg2+、Fe2+、Na+、K+、Ba2+对豇豆GAD的活力稍有影响,使酶活下降6-11%。Cu2+对豇豆GAD的活力影响较大,酶活力下降一半。
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