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研究背景全身麻醉是指麻醉药物诱导产生的一种可逆的意识消失、健忘、镇痛和运动不能的状态。全身麻醉已广泛应用于临床,具有非常重要的临床价值。然而其作用的核心机制至今仍未被解析。目前关于“全麻药物诱导意识消失”的机制主要有“Bottom-Up”与“Top-Down”理论。相较于“Bottom-Up”理论,目前对“Top-Down”理论的研究未得到研究人员的足够重视。“Top-Down”理论认为麻醉药物通过调节与神经信息整合相关的皮质-皮质及皮质-丘脑环路进而诱导意识消失。现有对“Top-Down”理论的探索主要集中于利用EEG、PET及f MRI等技术进行麻醉药物导致皮质功能连接改变的临床研究。在基础研究中使用光遗传、活体荧光成像等技术深度剖析“Top-Down”理论的分子及环路机制将有助于最终揭示全麻药物作用机制,乃至意识形成之谜。大脑皮质具有非常复杂的网络结构及功能,结构上包含不同的分区。根据所执行功能不同,大脑皮质可分为高级脑功能皮质区和初级脑功能皮质区,前者如内侧前额叶皮质,后者如初级视觉皮质。高级脑功能皮质区向初级脑功能皮质区的功能性投射构成了皮质的反馈性连接。皮质内反馈连接的破坏是全麻药物诱导意识消失的“TopDown”理论的一个重要方面。此外,复杂的皮质网络主要由兴奋性锥体神经元（PC）和分别表达小白蛋白（PV）,生长抑素（SOM）或血管活性肠肽（VIP）三种分子的抑制性中间神经元组成。它们彼此通过突触相连形成一个复杂的皮质神经网络,释放γ-氨基丁酸（GABA）和谷氨酸神经递质。最新研发的i GABASn FR和i Glu Sn FR的遗传编码荧光探针使得追踪大脑内高时空分辨率的GABA和谷氨酸神经递质动态变化成为可能,有助于揭示皮质兴奋性-抑制性网络介观尺度的动态变化。本课题利用活体双光子成像、光纤记录、光遗传等技术研究了初级视觉皮质及内侧前额叶皮质内各类神经元在异氟醚麻醉中的动态变化,并特别关注了内侧前额叶皮质内锥体神经元对异氟醚麻醉的调控作用。第一部分初级视觉皮质网络内各类神经元在异氟醚麻醉中的动态变化观察【目的】本实验旨在观察异氟醚麻醉下,初级视觉皮质网络内锥体神经元、PV神经元、SOM神经元及VIP神经元所接收GABA和谷氨酸递质输入及自身钙活动的动态变化。【方法】以特定方式将AAV-DIO-i GABASn FR、AAV-DIO-i Glu Sn FR及AAV-DIOGCa MP6m病毒注射到2-4月龄的C57BL/6J小鼠、PV-ires-Cre、SOM-ires-Cre和VIPires-Cre转基因小鼠的初级视觉皮质内,标记该区域的锥体神经元、PV神经元、SOM神经元及VIP神经元。每个观察组的小鼠例数均不低于3只。病毒注射同时埋置玻璃颅窗及脑电电极。待病毒成功表达后,将小鼠置于头部固定架上并连接自制的异氟醚吸入通路,利用高时空分辨率的活体双光子显微成像技术记录初级视觉皮质2/3层内四类神经元在1.2%浓度的异氟醚麻醉下所接收GABA和谷氨酸递质及自身钙活动的动态变化。同时全程记录脑电以评估小鼠的意识状态,并用免疫荧光染色观察AAV-DIO-i GABASn FR、AAV-DIO-i Glu Sn FR及AAV-DIO-GCa MP6m病毒在皮质四类神经元中的表达情况。【结果】1)AAV-DIO-i GABASn FR、AAV-DIO-i Glu Sn FR及AAV-DIO-GCa MP6m病毒可在锥体神经元、PV神经元、SOM神经元和VIP神经元中成功表达。2)EEG信号显示给予异氟醚后的10分钟内,标化γ波功率逐渐下降,爆发性抑制率则逐渐增加,小鼠可稳定进入意识消失状态。3)与清醒期相比,给予异氟醚后初级视觉皮质2/3层内锥体神经元（ΔF/F:15.37±15.3%vs.-4.22±3.98%,n=26/3）、PV神经元（ΔF/F:11.47±18.59%vs.-5.98±11.16%,n=32/5）、SOM神经元（ΔF/F:22.49±10.01%vs.-0.07±5.65%,n=27/4）和VIP神经元（ΔF/F:10.4±13.53%vs.-6.17±6.37%,n=82/7）所接收的GABA递质输入均下降,且各类神经元的?F/F（Ana-awake）与斜率值无统计学差异。4)与清醒期相比,初级视觉皮质2/3层内锥体神经元（ΔF/F:6.09±4.85%vs.-1.75±2.82%,n=24/3）、PV神经元（ΔF/F:13.99±19.06%vs.-6.61±8.44%,n=49/6）、SOM神经元（ΔF/F:9.71±19.3%vs.-11.93±12.22%,n=28/4）和VIP神经元（ΔF/F:15.79±18.32%vs.-5.77±7.86%,n=84/7）所接收的谷氨酸递质输入亦下降;异氟醚麻醉下锥体神经元接收谷氨酸递质的下降幅度（?F/F（Ana-awake）及斜率值）显著低于各类抑制性中间神经元。5)给予异氟醚麻醉后3-6分钟,VIP神经元（n=103/5）的钙事件及总钙活动高于PV神经元（n=49/5）和SOM神经元（n=52/7）;异氟醚麻醉下VIP神经元的相关系数r平均值高于清醒期。6)异氟醚麻醉下PV神经元被抑制程度（?F/F（Ana-awake）及斜率值）高于SOM神经元;异氟醚麻醉下PV神经元和SOM神经元的相关系数r平均值均高于清醒期;且在异氟醚麻醉下,PV神经元的相关系数r平均值高于其他两类中间神经元。【结论】在异氟醚麻醉诱导的意识消失期,初级视觉皮质网络内各类神经元接收的GABA递质输入均被抑制,且各类神经元的被抑制程度无细胞特异性。与各类抑制性中间神经元所接受谷氨酸递质输入明显下降不同的是,异氟醚麻醉下锥体神经元接收的谷氨酸递质输入得到了保留。异氟醚麻醉下,各类抑制性中间神经元的钙活动呈现出异质性,VIP神经元呈延迟抑制效应,PV神经元被抑制程度最深且同步化程度最高。本部分实验结果提示:在异氟醚麻醉诱导的意识消失期,初级视觉皮质的兴奋-抑制网络被破坏,具备功能的皮质抑制性神经网络可能在维持机体意识中发挥重要作用。内侧前额叶皮质内锥体神经元参与调控异氟醚麻醉研究第二部分【目的】本实验旨在观察异氟醚麻醉下,内侧前额叶皮质网络内各类神经元钙活动的动态变化;研究内侧前额叶皮质网络内锥体神经元对异氟醚麻醉的调控作用。【方法】1)以特定方式将AAV-DIO-GCa MP6m病毒注射到7-8周龄的C57BL/6J小鼠、PVires-Cre、SOM-ires-Cre和VIP-ires-Cre转基因小鼠的内侧前额叶皮质内,分别标记内侧前额叶皮质内的锥体神经元、PV神经元、SOM神经元及VIP神经元,同时埋置脑电电极和光纤陶瓷插芯。待病毒成功表达后,实时同步监测异氟醚麻醉下的脑电信号及内侧前额叶皮质内各类神经元的钙活动。2)将AAV-DIO-GCa MP6m与AAV-CAMKⅡ-cre的病毒混合液分别注射到7-8周龄的C57BL/6J小鼠的初级视觉皮质和初级体感皮质内,标记这两个区域内的锥体神经元。待病毒成功表达后,实时同步监测异氟醚麻醉下的脑电信号及初级感觉皮质内锥体神经元的钙活动,分析内侧前额叶皮质、初级视觉皮质及初级体感皮质内锥体神经元在脑电爆发波阶段与抑制波阶段钙活动的差值,即ΔF/F（BurstSuppression）。3)将AAV-DIO-Ch R2与AAV-CAMKⅡ-cre的病毒混合液注射到7-8周龄的C57BL/6J小鼠的内侧前额叶皮质和初级视觉皮质内,同时埋置脑电电极和光纤陶瓷插芯。待病毒表达成功后,进行异氟醚麻醉下脑电监测实验。在给予异氟醚麻醉第30分钟和第35分钟时,分别给予两次蓝光刺激,观察对脑电爆发性抑制波的影响。【结果】1)给予异氟醚后,内侧前额叶皮质内锥体神经元的钙活动高于三类抑制性中间神经元（PC:-12.02±3.55%,n=6,PV:-24.35±7.08%,n=7,SOM:-37.56±3.5%,n=6,VIP:-24.43±5.16%,n=5）。2)内侧前额叶皮质内锥体神经元在脑电爆发波阶段的钙信号强度高于其在抑制波阶段的钙信号强度（-16.07±6.8%vs.-19.55±6.8%,n=6）。3)内侧前额叶皮质（m PFC）内锥体神经元钙活动的ΔF/F（Burst-Suppression）值显著高于初级视觉皮质（V1）和初级体感皮质（S1BF）内锥体神经元钙活动的ΔF/F（Burst-Suppression）值（m PFC:3.48±0.45%,n=6,V1:1.84±0.65%,n=5,S1BF:1.33±0.74%,n=5）。4)蓝光激活内侧前额叶皮质（m PFC）内锥体神经元后,脑电爆发性抑制率显著降低（BF-sti-1:76.8±8.52%,sti-1:39.08±15.54%,AF-sti-1:59.74±16.73%,n=8;BF-sti-2:72.49±14.77%,sti-2:54.89±10.95%,AF-sti-2:75.11±9.82%,n=8）;蓝光激活初级视觉皮质（V1）内锥体神经元对脑电爆发性抑制率无影响。【结论】异氟醚麻醉对内侧前额叶皮质内锥体神经元钙活动的抑制程度最低,且并未完全抑制锥体神经元的钙活动;异氟醚麻醉下内侧前额叶皮质内锥体神经元的钙活动呈爆发-抑制的振荡模式,并且时程上与脑电爆发抑制波保持一致;初级感觉皮质内锥体神经元钙活动的爆发-抑制振荡强度弱于内侧前额叶皮质内锥体神经元;并非所有皮质锥体神经元均可调控脑电爆发性抑制波的形成,激活内侧前额叶皮质内锥体神经元的活动可有效逆转脑电爆发性抑制波。本部分研究结果证实位于内侧前额叶皮质的锥体神经元是脑电爆发性抑制波形成的重要开关,参与调控异氟醚麻醉深度。