DKK1蛋白在炭疽杆菌(Bacillus anthracis)毒素入胞过程中的功能研究

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炭疽毒素在由炭疽杆菌引起的炭疽热发病机制中起着关键作用。炭疽毒素由三种毒蛋白组成:保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)。PA主要负责与细胞膜表面毒素受体(ANTXRs)结合并将有毒的LF或EF运输到细胞质内。前期的研究工作表明在细胞膜表面除了炭疽毒素受体之外,另一个在经典Wnt信号通路中的辅受体,低密度脂蛋白受体蛋白6(LRP6),也作为炭疽毒素辅受体参与到促使PA介导的炭疽毒素内化以及致死过程中,但它的这一作用存在一定的争议。  在本课题中通过生化和免疫荧光实验发现分泌型蛋白Dickkopf1(DKK1)作为LRP6的一个高亲和性配体,也是LRP6在经典的Wnt信号通路中的功能拮抗剂,可以促使PA介导的炭疽毒素入胞以及致死。RNAi介导的DKK1下调或者TALENs技术介导的DKK1基因敲除能够降低细胞对PA介导的炭疽毒素敏感性,证明DKK1主动参与到炭疽毒素的致死过程中。  另一方面,不同细胞系中外源表达DKK1会对PA介导的炭疽毒素敏感性产生不同的影响:M2182和RAW264.7细胞对毒素的敏感性降低,HeLa、HEK293T、BHK细胞对毒素的敏感性增强。进一步研究结果发现DKK1在HeLa、HEK293T细胞中表达量较低,而在M2182细胞中表达量较高,这表明DKK1在炭疽毒素入胞和致死过程中的功能受细胞内其他因素的影响。通过在DKK1低表达背景的HEK293T和无表达的M2182/DKK1-/-细胞中表达不同剂量的DKK1,观察到DKK1在抑制Wnt信号通路中存在剂量依赖性表型,而在细胞对炭疽毒素敏感性中存在双向表型。这一结果进一步证实DKK1作用的确与细胞内容物相关。  免疫荧光和生化实验结果显示DKK1与已报道的两个炭疽毒素受体蛋白ANTXR1/2存在相互作用。与之前报道的LRP6结果类似,缺失DKK1也会影响炭疽毒素的入胞过程,这进一步证明了DKK1与LRP6在炭疽毒素入胞过程中的协同作用。  研究结果表明PA-ANTXR1/2-LF/EF毒素复合物通过利用DKK1与LRP6、Kremen-1/2在细胞膜表面形成的三聚体结构以及内化机制实现自身的入胞过程,任何单一蛋白或者两两组合都无法帮助炭疽毒素完成入胞过程。  针对人源DKK1不同抗原决定部位的单克隆抗体在炭疽杆菌天然毒素PA/LF处理中可以剂量依赖性地保护炭疽的宿主细胞小鼠巨噬细胞RAW264.7,这一结果进一步证明DKK1在炭疽宿主细胞内化毒素和致死过程中起着积极的作用。Wnt信号通路成员在炭疽毒素入胞以及致死过程中存在新的功能,这一研究结果不但拓宽了对于炭疽热疾病的理解,也为该疾病的治疗提供了新的药物靶点。
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