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近年来,肿瘤放射治疗发展迅速。放疗可通过杀伤肿瘤细胞抑制肿瘤生长,并提高患者生存期。据统计,约40%的肿瘤患者可以经放疗彻底治愈。但放疗后仍有部分肿瘤患者发生复发转移。临床研究表明,放疗后肿瘤患者体内高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1,HMGB1）的水平明显升高,且高水平HMGB1与患者预后差显著相关。放疗后肿瘤细胞受损伤甚至死亡会释放大量HMGB1于肿瘤微环境中。HMGB1作为肿瘤微环境中的重要成分,可显著促进肿瘤细胞的增殖侵袭和转移。肿瘤一旦复发转移,临床上并没有有效的手段加以控制。HMGB1是结构上高度保守的非组蛋白核蛋白,分子上分布着多种受体结合区域,可与肝素、晚期糖基化终产物受体（receptor of advanced glycation end products,RAGE）和 Toll 样受体 4（toll-like receptors 4,TLR4）等结合并发挥不同的作用。TLR4是天然免疫系统识别病原微生物的主要受体,在天然免疫反应中扮演着关键性作用。研究表明,HMGB1与肿瘤细胞膜上TLR4结合后可促进肿瘤细胞的增殖,同时也促进肿瘤细胞转移和肿瘤组织周围血管新生。肿瘤微环境中的HMGB1可激活树突状细胞（dendritic cells,DCs）,并通过促进DCs介导的CD8+T细胞的激活,诱导干扰素γ的分泌。HMGB1还可激活T细胞的Thl极化,并增强T细胞浸润。研究发现,低剂量放疗诱导巨噬细胞向抗肿瘤的M1型分化,而HMGB1促进巨噬细胞向促肿瘤的M2型分化。MMP-9通过降解和调整细胞间基质使肿瘤细胞脱离原发肿瘤部位进入血管进行转移。HMGB1可激活TLR4下游MAPK/MyD88和p38/Nrf2信号通路,上调MMPs的转录和翻译,从而促进肿瘤的发展。转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）负责启动细胞的上皮-间充质转化过程。研究报道,HMGB1激活TLR4介导的信号通路,通过诱导促炎细胞因子IL-1b和IL-6的释放招募髓源抑制细胞,髓源抑制细胞释放TGF-β1,可提高肿瘤细胞的侵袭性。研究发现,肝素与HMGB1具有高亲和力,与HMGB1 N端第6～12个氨基酸序列结合后,可改变HMGB1二维结构,进而干扰HMGB1与RAGE的结合。因此可以推测,肝素与HMGB1结合后,对于后者与TLR4的结合及所介导的对肿瘤生长和侵袭作用也能发挥干扰和抑制作用。这或有助于应对放疗后肿瘤的复发和转移。但是,肝素强大的抗凝活性使其在临床应用中存在出血性风险。因此,研发HMGB1抑制剂时需要将肝素进行衍生化,以降低其抗凝活性,并同时保留其与HMGB1的高亲和力。本课题组前期对肝素进行N-位脱硫酸/全乙酰化处理,得到具有低抗凝活性的 N-位脱硫酸全乙酰化肝素衍生物（N-desulfated acetylated heparin derivative,NDSAH）。研究发现,NDSAH通过抑制肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、IL-6 和基质金属蛋白-9（matrixmetalloproteinas-9,MMP-9）的上调,保护血管内皮及肠道上皮细胞糖萼,从而提高脓毒症小鼠的生存率。本课题将肝素钠进行衍生化制备NDSAH,通过核磁共振进行结构确证并考察其抗凝活性;在分子水平上,通过表面等离子体共振技术（surface plasmon resonance,SPR）,考察肝素钠、NDSAH、HS、三种低分子肝素（那屈肝素钙、依诺肝素钠、达肝素钠）、甘草酸二钾盐（HMGB1抑制剂）和TLR4与HMGB1的亲和作用,并检测上述分析物拮抗HMGB1/TLR4的能力,筛选出NDSAH、肝素钠和HS这三个与HMGB1蛋白具有高亲和作用的分子;在细胞水平上,首先考察放疗对4T1肿瘤细胞增殖和释放HMGB1水平的影响,然后研究NDSAH、肝素钠和HS对4T1肿瘤细胞增殖和拮抗HMGB1促其增殖和转移的能力;在动物水平上,将放疗与NDSAH等联合应用于4T1荷瘤小鼠,通过对其肿瘤生长、血浆和肿瘤组织中HMGB1、MMP-9、TGF-β水平变化及肿瘤微环境中IFN-γ+CD8+T细胞、M1型和M2型巨噬细胞数量的考察,探讨NDSAH联合放疗拮抗HMGB1促肿瘤细胞增殖和迁移的作用。本研究取得的结果以及结论主要有:1.NDSAH的制备及抗凝效价检测1.1 NDSAH的制备及核磁共振结构确证本课题将肝素钠在吡啶和DMSO/MeOH反应下选择性脱去其N-硫酸基,并在NaHCO3/MeOH和乙酸酐存在下进行N-脱硫酸肝素衍生物的N-乙酰化,最终得到NDSAH,核磁共振结果符合预期。1.2 NDSAH的抗凝效价检测通过羊血浆法检测NDSAH和HS的抗凝效价,结果为:NDSAH 0.39IU/mg,HS 1.94IU/mg,NDSAH抗凝效价远低于肝素钠（200IU/mg）。这说明NDSAH为非抗凝肝素类衍生物,无出血风险。2.NDSAH等与HMGB1的亲和作用强弱以及拮抗HMGB1/TLR4的能力2.1 NDSAH等与HMGB1的亲和作用研究通过SPR技术考察肝素衍生物、HS和甘草酸二钾盐与HMGB1的亲和作用规律。结果显示,上述分析物与HMGB1蛋白亲和力大小排序为:肝素钠＞NDSAH＞HS＞甘草酸二钾盐＞TLR4＞达肝素钠＞依诺肝素钠＞那屈肝素钙。这说明肝素衍生物的分子量、硫酸化程度和N-乙酰化程度均影响其与HMGB1的亲和作用。2.2 NDSAH等拮抗HMGB1与TLR4亲和作用的考察运用SPR技术在Dual injection模式下检测肝素衍生物、HS和甘草酸二钾盐拮抗HMGB1/TLR4的能力。结果显示,NDSAH、肝素钠和HS可以拮抗TLR4与HMGB1的结合,而三种低分子肝素--达肝素钠、那屈肝素钙和依诺肝素钠则不能拮抗HMGB1/TLR4的结合。这说明NDSAH等与TLR4竞争与HMGB1结合的能力取决于其与HMGB1亲和力大小,与HMGB1亲和力大于HMGB1与TLR4亲和力的肝素类衍生物可以拮抗HMGB1/TLR4的结合,反之则不能。3.NDSAH、肝素钠和HS对HMGB1促细胞增殖及迁移作用的影响3.1 X射线对4T1细胞增殖的影响分别用0Gy、6Gy和12Gy X射线照射4T1细胞,并于照射后24h、48h和72h用CCK8检测细胞增殖率。结果显示,与0Gy组相比,6Gy与12Gy X射线照射4T1细胞24h、48h和72h后细胞增殖率均显著降低（**P＜0.01,***P＜0.001）。与照射后24h相比,照射后48h细胞增殖率进一步降低（6Gy,#P＜0.05;12Gy,###P＜0.001）;与照射后24h和48h相比,照射后72h细胞增殖率持续降低（24h和48h,###P＜0.001）。以上结果说明,放疗影响4T1细胞的增殖,随着照射后时间的推移,细胞增殖能力持续下降,且X射线剂量越大,细胞增殖潜力越小,说明X射线对细胞增殖的影响具有剂量依赖性。3.2 X射线照射后4T1细胞HMGB1释放水平测定用ELISA法考察不同强度X射线照射4T1细胞后,细胞培养上清中HMGB1释放水平。结果显示,与0Gy组相比,6Gy和12Gy X射线照射细胞24h、48h和72h后细胞上清中HMGB1水平均显著增加（24h,**P＜0.01,***P＜0.001;48h,#P＜0.05,*P＜0.05;72h,**P＜0.01,***P＜0.001）,且照射后24h和72h时,12Gy X射线照射后细胞上清中HMGB1浓度均显著大于6Gy X射线照射后细胞上清中HMGB1浓度（24h,#P＜0.05;72h,###P＜0.001）;与照射后24h相比,各剂量X射线照射4T1细胞48h和72h后细胞释放HMGB1的量无显著性差异（P＞0.05）。以上结果说明,X射线以剂量依赖性影响4T1细胞释放HMGB1水平,随着X射线剂量增加,细胞释放HMGB1水平升高;但各剂量X射线照射4T1细胞24h后细胞释放的HMGB1量即不再增加。3.3不同浓度HMGB1对4T1细胞增殖的影响125ng/mL、250ng/mL 和 500ng/mL HMGB1 作用 4T1 细胞后,用 CCK8 检测24h和48h细胞增殖情况。结果显示,24h时,与空白组相比,250ng/mL和500ng/mL HMGB1组细胞增殖率均显著升高（**P＜0.01,***P＜0.001）,且500ng/mLHMGB1组细胞增殖率大于250ng/mLHMGB1组细胞增殖率;48h时,与空白组相比,不同浓度HMGB1均显著促进4T1细胞增殖（***P＜0.001）;24h和48h时,HMGB1对4T1细胞增殖的促进作用无浓度依赖性。以上实验结果说明,HMGB1可促进4T1细胞增殖,当HMGB1浓度为500ng/mL且作用时间为48h时,对细胞的促增殖作用最强。3.4 NDSAH等对4T1细胞增殖作用的影响62.5μg/mL、125μg/mL、250μg/mL 和 500μg/mLNDSAH、肝素钠或 HS 分别作用于4T1细胞24h后,CCK8检测细胞增殖情况。结果显示,与空白组相比,不同浓度NDSAH、肝素钠或HS均显著抑制4T1细胞的增殖（NDSAH,**P＜0.01,***P＜0.001;肝素钠,**P＜0.01,***P＜0.001;HS,***P＜0.001）,但对4T1细胞增殖的抑制作用无浓度依赖性。3.5 NDSAH等对HMGB1促4T1细胞增殖的抑制作用研究不同浓度NDSAH、肝素钠和HS分别作用于4T1细胞后,CCK8检测4T1细胞增殖情况。结果显示,与空白组相比,HMGB1组细胞增殖率明显升高（##P＜0.01）;与 HMGB1 组相比,不同浓度（62.5μg/mL、250μg/mL 和 500μg/mL）NDSAH、肝素钠和HS均显著降低4T1细胞的增殖率（NDSAH,***P＜0.001;肝素钠,***P＜0.001;HS,***P＜0.001,**P＜0.01）,且它们抑制HMGB1促增殖的作用均显示出浓度依赖性。与HMGB1组相比,甘草酸组（HMGB1抑制剂）和TLR4-IN-C34组（TLR4抑制剂）细胞增殖率也明显降低（***P＜0.001）。NDSAH、肝素钠和HS拮抗HMGB1促细胞增殖作用能力大小为:肝素钠＞NDSAH～HS。以上结果说明,HMGB1可以促进4T1细胞增殖。NDSAH、肝素钠和HS均以浓度依赖性方式拮抗HMGB1促细胞增殖作用,且它们拮抗HMGB1促细胞增殖的作用可能与HMGB1/TLR4信号通路有关。3.6 NDSAH等对HMGB1促4T1细胞迁移的抑制作用研究划痕实验观察不同浓度（62.5μg/mL、250μg/mL和500μg/mL）NDSAH、肝素钠和HS在不同时间点（24h和48h）对HMGB1促细胞迁移作用的影响。结果显示,与空白组相比,HMGB1组细胞划痕愈合率显著升高（24h和48h,###P＜0.001）;与 HMGB1 组相比,不同浓度（62.5μg/mL、250μg/mL 和 500μg/mL）肝素钠和HS作用4T1细胞24h和48h后细胞划痕愈合率均显著降低（*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001）,但肝素钠和HS对HMGB1促细胞迁移的抑制作用无浓度依赖性;与HMGB1组相比,500μg/mLNDSAH组划痕愈合率显著降低（24h和 48h,*P＜0.05）,而 62.5μg/mL 和 250μg/mL NDSAH 不能抑制 HMGB1 的促细胞迁移作用;与HMGB1组相比,甘草酸组和TLR4-IN-C34组细胞划痕愈合率均明显降低（*P＜0.05）。NDSAH、肝素钠和HS抑制HMGB1的促细胞迁移作用能力大小为:肝素≈HS＞NDSAH。上述结果表明,HMGB1蛋白可促进4T1细胞的迁移,而NDSAH、肝素钠和HS可抑制HMGB1的促细胞迁移作用,该抑制作用可能是通过靶向HMGB1/TLR4信号通路实现的。4.NDSAH对4T1荷瘤小鼠放疗后肿瘤微环境和肿瘤生长的影响4.1 NDSAH等联合放疗后4T1荷瘤小鼠血浆中HMGB1、MMP-9和TGF-β水平检测本实验采用ELISA法进行检测。结果显示,与生理盐水组相比,X射线组小鼠血浆中HMGB1、MMP-9和TGF-β水平均显著升高（HMGB1、MMP-9,###P＜0.001;TGF-β,#P＜0.05）;与X射线组相比,NDSAH、肝素钠或HS联合放疗可显著降低荷瘤小鼠血浆中HMGB1（***P＜0.001,**P＜0.01,***P＜0.001）、MMP-9（***P＜0.001）和 TGF-β（*P＜0.05,**P＜0.01）水平。此外,甘草酸和TLR4-IN-C34联合放疗与单纯放疗相比小鼠血浆中HMGB1（***P＜0.001）、MMP-9（***P＜0.001）和 TGF-β（*P＜0.05,**P＜0.01）水平均显著降低。上述结果说明,放疗可促进HMGB1、MMP-9和TGF-β的释放,NDSAH、肝素钠和HS可通过抑制HMGB1的释放降低放疗后血浆中MMP-9和TGF-β水平。4.2 NDSAH等联合放疗后4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中HMGB1、MMP-9和TGF-β水平检测本实验采用免疫组化法进行检测。结果显示,与生理盐水组相比,放疗后小鼠肿瘤组织中 HMGB1（##P＜0.01）、MMP-9（#P＜0.05）和 TGF-β（#P＜0.05）蛋白水平显著升高;与X射线组相比,NDSAH、肝素钠或HS联合放疗后小鼠肿瘤组织中上述蛋白水平均显著降低;与X射线组相比,甘草酸和TLR4-IN-C34联合放疗后小鼠肿瘤组织中HMGB1（**P＜0.01,*P＜0.05）、MMP-9（***P＜0.001;**P＜0.01）和 TGF-β（*P＜0.05,**P＜0.01）蛋白的水平也显著降低。上述结果说明,NDSAH、肝素钠和HS联合放疗可抑制放疗导致的肿瘤组织中HMGB1蛋白水平的升高,并进一步导致MMP-9和TGF-β水平也降低。4.3 NDSAH等联合放疗后4T1荷瘤小鼠肿瘤组织中部分免疫相关细胞检测本实验采用免疫荧光双标法进行检测。结果显示,与生理盐水组相比,X射线放疗后,肿瘤组织中存在大量IFN-γ+CD8+T细胞;与X射线组相比,X射线+肝素钠组、X射线+NDSAH组、X射线+HS组、X射线+甘草酸组和X射线+TLR4-IN-C34组小鼠肿瘤组织中IFN-γ+CD8+T细胞的数量减少。巨噬细胞检测结果显示,与生理盐水组相比,X射线组小鼠肿瘤组织中M1型巨噬细胞数量增加,M2型巨噬细胞数量减少;与X射线组相比,X射线+肝素钠组、X射线+NDSAH组、X射线+HS组、X射线+甘草酸组和X射线+TLR4-IN-C34组小鼠肿瘤组织中M1型巨噬细胞数量增加,M2型巨噬细胞数量减少。上述结果表明,NDSAH等可抑制放疗后IFN-γ+CD8+T细胞浸润至肿瘤组织,并促进巨噬细胞分化成具抗肿瘤活性的M1型巨噬细胞。4.4 NDSAH等对4T1荷瘤小鼠放疗后肿瘤组织重量的影响NDSAH、肝素钠或HS联合放疗后,解剖取小鼠肿瘤组织并称重。结果显示,与生理盐水组相比,X射线组小鼠肿瘤组织重量明显降低（*P＜0.05）;与X射线组相比,除X射线+甘草酸组外（P＞0.05）,其他联合治疗组小鼠肿瘤组织重量均显著降低（#P＜0.05）。该结果说明,放疗可抑制肿瘤细胞增殖,NDSAH、肝素钠和HS可进一步抑制放疗后肿瘤组织的生长。5.结论非抗凝肝素衍生物NDSAH主要通过降低放疗后HMGB1的释放水平,并通过拮抗HMGB1/TLR4信号通路,促进M1型巨噬细胞的分化,下调MMP-9、TGF-β水平,从而抑制放疗后HMGB1诱导的肿瘤细胞增殖和迁移;同时,NDSAH还具有缓和的肿瘤细胞增殖抑制作用。这提示NDSAH或可降低放疗后肿瘤细胞复发转移的风险,成为肿瘤放疗联合治疗的新选择。