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研究背景Rh血型系统是人类最重要血型系统之一,具有非常重要的临床意义。Rh血型除正常表型外,还存在诸多变异体血型,相关个体可以产生同种抗体,导致溶血性输血反应（HTR）以及致死性胎儿和新生儿溶血病（HDFN）等。高加索人群中比较早而系统地进行了 RhD变异体的RHD基因分型研究并指导临床用血。近年,国内数个有条件的血液中心或实验室陆续开展对中国人群RhD变异体的研究,但中国属于多民族国家,遗传背景丰富,因此,中国人群中RhD变异体的系统研究资料有待完善。以往研究表明,RhD变异体表型大多数由Rh血型系统编码基因RHD及RHCE突变所致,主要与D抗原相关,包括部分D（partial D）、弱D（weak D）以及D放散型（Del）。中国汉族人群中弱D15和DVI.3是最常见的RhD变异体,占中国报道的RhD变异个体的65%以上,随着分子生物学的发展、新检测技术的应用,在中国人群中将发现越来越多新的RHD变异型等位基因。本研究目的是探究广州地区的RhD变异体的分子生物学特征,通过构建体外表达体系,可以有效阐明RHD等位基因的表达特征和调控机制,探究RHD等位基因与D抗原表型之间的因果关系,为阐明我国人群Rh变异体的血型分子基础、建立相应基因检测及安全输血策略提供依据。目的1、探讨广州地区RhD变异体个体D抗原的表位特征及基因突变遗传分子机制,了解本地区RhD变异体类型分布。2、构建用于研究RHD等位基因D抗原的293T细胞（人胚肾细胞）体外表达体系,为阐明本地区人群Rh变异体血型分子基础、建立相应基因检测及安全输血策略提供依据。方法1、2019年1月～8月,在广州地区无偿献血者中检测出的RhD变异体、本地区医疗机构送至本中心实验室做Rh疑难血型鉴定并经血清学方法筛查后确认为RhD变异体的患者血液标本共59例;对课题组前期发现1例新RhD变异型（RHD*497G）等位基因做体外表达研究。2、用2种单克隆抗-D试剂及D-screen抗原表位检测试剂盒进一步分析D抗原表位的血清学特征,并做RhCE表型分型;采用QuickGene DNA提取试剂盒提取标本的基因组DNA,采用PCR-RFLP方法做RHD基因合子型分析;利用多重连接依赖探针扩增（MLPA）基因分型法做RHD基因型检测,并对仍存疑标本做RHD外显子（exon1～exon10）Sanger 测序,用 DNAStar/SeqMan 软件对结果进行分析。3、构建目标基因（RHD*497G）质粒,培养293T细胞,使用FuGENE（?）6转染试剂将目标DNA（RHD*497G）转染至293T细胞,进行体外表达,利用一些列针对不同RhD抗原表位的单克隆抗-D,使用流式细胞技术检测D抗原表位的表达。结果1、本组广州地区RhD变异体中,检出来自献血者的占27.12%（16/59）[占同期广州献血者的比例为0.007%（16/232 793）],医院送检的患者疑难标本占72.88%（43/59）。59例RhD变异体RhCE主要表型分布为39%（23/59）的Ccee、35.6%（21/59）的 ccEe、25.4%（15/59）的 CcEe。2、RHE基因型检测:40.7%（24/59）为RHD*weak partial 15、25.4%（15/59）为RHD*DVI.3以及33.9%（20/59）其他较少见的RhD变异型类型[这当中合并2种不同等位基因的RhD变异体又占76.92%（10/13）]。血清学显示DVI.3型细胞与D-screen试剂盒中九种单抗呈现相对格局,即与一种抗-D抗体（克隆号:P3*212 23B10）呈阳性反应,与该试剂盒中其余单克隆抗-D呈阴性反应;其余RhD变异体无法用血清学进行明确鉴定。3、本次研究中RHD+/RHD+纯合子有 10 例（16.95%,10/59）,RHD+/RHD-杂合子有49例（83.05%,49/59）,提示本地区RhD变异型等位基因的缺失率比例高,即RHD+/RHD-型等位基因为本地区RhD变异体的主要基因组合类型。4、目的DNA（RHD*497G）转染至293T（人肾上皮细胞）,培养细胞表达RHD基因表达的抗原,流式细胞仪检测结果;检测单克隆抗-D克隆号（抗原表位）检测结果分别为:5C8（2.2）:+++,21G6（9.1）:+++,Brad-8（2.2）:++,FoG-1（6.7）:+++,D59897:+++,H41（3.1）:+++,HIRO-4（9.1）:+++,HIRO-5:+,HIRO-9（6.3）:+++,LHM76/58（8.1）:+++,LHM50/2B（6.3）:++,LHM76/55（3.1）:+++,LHM76/59（15.1）:+++,Los-1（6.3）:++,Los-2:++,MmABS a-D:+++,MS26（9.1）:+++,poly a-D:+++,P3×241（5.4）和Brad-5（6.8）呈阴性表达。结论1、弱D15和DVI.3为广州地区汉族人群最常见RhD变异体类型,其中DVI可以通过D-screen试剂盒抗-D试剂等血清学方法得到初步鉴定,而其余RhD变异体均需要分子生物学方法才能得到鉴定;本研究中100%的D变异体均含有C或E抗原。2、变异型（RHD*497G）通过创建体外表达体系成功表达,结果呈现部分D抗原表型与血清学检测结果一致。通过流式细胞技术检测出相应不同抗原的强度或者缺失情况,可更加客观证实其对相应先证者红细胞D抗原表位异常表达的分子基础,具有重要科学意义,可为该类型RhD变异体的输血指导原则及孕期监测策略提供依据。