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近年来,基因治疗已经受到越来越多的关注。而基因转运载体是决定这一疗法效果关键因素之一。病毒作为基因转运的载体,虽然病毒载体转染效率高,但是病毒载体存在着严重的安全隐患,而且生产成本高。非病毒载体与病毒载体相比,有着毒性低、免疫原性小、生产成本低、基因装载容量大等优点。天然活性成分A作为一种天然高分子材料,具有良好的生物相容性和生物可降解性,几乎无毒性和免疫原性,而且具有易于修饰,是制备非病毒基因载体的理想材料。本论文工作的目的是从一种食用菌中提取活性成分A,并以此作为骨架材料,对其进行阳离子化修饰,并对阳离子化产物进行一系列表征,通过阳离子化合物与质粒DNA的毒性试验和体外对大鼠骨髓干细胞的转染试验,检测其毒性和转染效率。
本论文的工作是从食用菌P新鲜子实体中提取水溶性活性成分A。粗活性成分A经脱蛋白后上DEAE-52纤维素层析柱,再经Sephadex G-100凝胶柱层析得到单一组分PPS。经测定,PPS中糖醛酸含量为0.18％,PPS平均分子量为5.49×105Da。根据薄层色谱的分析结果,PPS的单糖组分以葡萄糖为主,同时含有少量的半乳糖,甘露糖和鼠李糖。
本文对PPS进行了精胺阳离子化修饰并对阳离子化产物CPPS进行了表征。CPPS的冻干品为乳白色粉末,具有良好的水溶性。通过三硝基苯磺酸(TNBS)法测得CPPS伯胺基的含量为3.21 mmol／g。经傅立叶红外光谱分析,从阳离子化前后的吸收峰变化,可以明显看出,精胺已经成功连接到PPS糖链上。
本文在实验室条件下制备了质粒DNA,并经紫外透射仪检测质粒在260nm和280nm处的光吸收值,得OD260／OD280值在1.8到1.9之间,符合转染条件。我们还成功分离培养了大鼠骨髓间质干细胞,并以CPPS为载体构建了CPPS-pDNA纳米粒,对CPPS-pDNA纳米粒的形态粒径以及电位进行了表征。透射电镜观测,CPPS-pDNA纳米粒在CPPS与质粒DNA质量比为20:1时,呈均一圆球形,粒径分布在20～50nm。
为探求适当的CPPS与质粒DNA质量比,本文对一系列不同质量比(CPPS与质粒DNA质量比分别为5:1,10:1,20:1,30:1,50:1,80:1)的CPPS／质粒DNA纳米粒进行了琼脂糖凝胶阻滞实验。结果表明,当CPPS与质粒DNA的质量比增加到10:1时,CPPS可以完全结合质粒DNA,将质粒DNA滞留在原孔。CPPS与质粒DNA质量比分别为10:1,20:1,30:1时,CPPS-pDNA复合物颗粒的粒径分别为284.3nm、80.8nm、151.1 nm,Zeta电位分别为17mV、17.2mV、19.2mV。
毒性实验结果表明,三种CPPS—pDNA纳米粒的细胞毒性均小于LipofectamineTM2000和PEI(25kDa)这两种非病毒基因转染对照试剂的毒性,说明本实验所制备的CPPS-pDNA纳米粒作为基因转运载体对细胞基本无毒性,安全性非常好。
体外细胞转染实验表明,CPPS与质粒DNA的质量比为20:1的CPPS-pDNA纳米粒转染的效果最佳,其转染效率显著高于LipofectamineTM2000,PEI(25kDa)以及游离质粒的转染效率。
总之,本论文工作中所制备的以食用菌P活性成分A为骨架的阳离子聚合物很有可能发展成为一种具有广阔前景的非病毒基因载体。