【摘 要】
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是广泛应用的微生物杀虫剂,可用于防治鞘翅目、直翅目、双翅目、膜翅目和鳞翅目的多种害虫,具有杀虫效果好和对人类畜类安全等优点。双组份信号转导系统（Two-component signal transduction system,TCS）简称双组份,是原核生物主要的信号转导系统,参与调控细菌的多种生理过程,如细菌的生长、芽胞形成、渗透压、抗
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苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）是广泛应用的微生物杀虫剂,可用于防治鞘翅目、直翅目、双翅目、膜翅目和鳞翅目的多种害虫,具有杀虫效果好和对人类畜类安全等优点。双组份信号转导系统（Two-component signal transduction system,TCS）简称双组份,是原核生物主要的信号转导系统,参与调控细菌的多种生理过程,如细菌的生长、芽胞形成、渗透压、抗生素抗性、趋化性、毒性、致病性以及营养元素的代谢等。大多数双组份由一对蛋白质组成,分别是位于细胞膜的组氨酸激酶（Histidine kinases）和位于细胞质的响应调节子（Response regulator）。组氨酸激酶能够感应环境中或细胞内的某种信号刺激,并发生自磷酸化,然后将磷酸基团传递给其对应的响应调节子,使响应调节子被激活;有活性的响应调节子能够作为转录因子去调控与该种信号刺激相关的基因的表达,使细胞对相应的信号刺激做出响应。双组份YvcPQ由组氨酸激酶YvcQ和响应调节子YvcP组成。目前关于YvcPQ的研究很少,主要集中在B.subtilis菌群的B.subtilis中,而关于包括B.thuringiensis在内的Bacillus cereus菌群的YvcPQ的研究几乎是一片空白,因此本课题选取B.thuringiensis中的YvcPQ作为主要的研究对象,深入探究YvcPQ相关的转录调控机制和生物学功能。本课题采用生物信息学分析、归巢内切酶介导的基因无痕敲除、细菌单杂交、凝胶阻滞和实时荧光定量PCR等方法主要完成了以下几个方面的工作:1)采用生物信息学的方法分析了yvcPQ及其下游基因在芽胞杆菌属中的分布,发现芽胞杆菌属中的yvcPQ及其下游基因可以大致分为三大类,第一类是以B.subtilis W168为代表的yvcPQ-RS,主要存在B.subtilis菌群的B.subtilis中;第二类是以B.thuringiensis BMB171为代表的yvcPQ-R-S1S2,主要存在于B.cereus菌群中;第三类是不同于上述两类的特殊的基因。此外,B.subtilis菌群和B.cereus菌群的yvcPQ及其下游基因也存在很大的差异,其相似性在50%以下。2)根据YvcP识别的核苷酸序列,在B.cereus菌群的B.thuringiensis BMB171中找到了4个受YvcPQ调控的基因（yvcR、BMB171＿C4385、kapD和BMB171＿C4835）,并在体外通过细菌单杂交实验验证了YvcP与4个基因启动子区DNA的结合,在体内通过实时荧光定量PCR实验验证了YvcP对4个基因的转录调控。3)通过将B.thuringiensis BMB171中yvcPQ的下游基因及其功能与B.subtilis W168中的相比较,阐释了B.thuringiensis中YvcPQ对杆菌肽的响应机制,发现YvcPQ不仅能够调控yvcR的转录,还能够调控位于yvcR下游的yvcS1S2操纵子的转录,从而帮助细胞响应杆菌肽刺激,解除杆菌肽对细胞的毒性作用。4)采用细菌单杂交、凝胶阻滞和实时荧光定量PCR等方法,阐释了B.thuringiensis中YvcPQ参与的一种芽胞形成的抑制机制,即:时期调控因子AbrB能够通过正调控yvcPQ操纵子的转录来提高细胞内的YvcP水平,进而增强YvcP对芽胞形成抑制因子基因kapD的转录激活,最终抑制芽胞的形成。5)采用归巢内切酶介导的基因无痕敲除方法得到了△yvcPQ和△kapD两株提前形成芽胞的基因突变株,为发酵周期短、成本低的新型基因工程菌株的构建奠定了基础。总之,本课题的研究结果揭示了双组份YvcPQ的多种类型和功能,为B.thuringiensis甚至B.cereus菌群中YvcPQ的研究提供了新的思路,本课题也为双组份信号转导系统的功能以及细菌芽胞形成的调控的研究奠定了基础。
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