研究背景脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）是一种常见的急性脑血管疾病,占所有脑卒中的20%。该疾病的特点是起病急,进展快,死亡率高,致残率高,严重影响患者的生活质量。ICH导致死亡和残疾的主要原因是血肿引起的一系列病理改变,如血肿的占位效应及其溶解所释放的有毒物质对周围脑组织造成损伤。早期清除血肿不仅可以解除占位效应,还可以防止血肿溶解产生的各种有毒物质所造成继发性脑损伤。因此,有效清除ICH后血肿对于减轻继发性脑损伤、促进神经功能恢复至关重要。中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）主要由两种细胞组成:神经元和胶质细胞,后者进一步分为小胶质细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。小胶质细胞是中枢神经系统内固有的巨噬细胞,具有清除受损或凋亡细胞及修剪突触的功能。研究表明,小胶质细胞可以清除ICH后血肿中的红细胞。在ICH小鼠模型中,给予增强小胶质细胞吞噬功能的药物可显著加速血肿的清除。过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（PPAR-γ）是一种核激素受体。有研究报道PPAR-γ能够通过抑制促炎基因的表达,增加抗炎基因、抗氧化基因的转录及翻译来抑制炎症反应和氧化应激反应。此外,亦有研究表明在脑外伤中PPAR-γ可通过抑制炎症反应和氧化应激来减轻神经元损伤。Axl和Mer TK受体酪氨酸激酶属于TAM（Tyro3,Axl和Mer TK）家族成员,它们是调节先天免疫应答和免疫细胞吞噬所必需的。Axl和Mer TK通常在大脑中表达。研究表明,小胶质细胞在神经发生或脑组织修复过程中需要TAM家族受体的调节作用。CD36是一种清道夫受体,具有多种生物学功能,如免疫细胞趋化作用和吞噬细胞吞噬作用。在ICH模型中,激活PPAR-γ可增加小胶质细胞中CD36的表达,增强小胶质细胞的吞噬功能,从而加速血肿的清除。溶酶体相关膜蛋白2（LAMP2）是一种溶酶体糖蛋白,在细胞中大量存在。作为蛋白质的受体,它可以直接将吞噬囊泡运输到溶酶体,也可介导吞噬-溶酶体融合,从而降解、消化吞噬囊泡内容物。汉黄芩素（Wogonin）是从中药黄芩中提取的一种天然生物黄酮。越来越多的研究表明,汉黄芩素具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和神经保护作用。例如,有关骨关节炎的研究表明,汉黄芩素可通过抑制活性氧（ROS）的产生来抑制氧化应激,从而保护关节软骨。汉黄芩素也常用于抗肿瘤的治疗,诱导肿瘤细胞凋亡,同时可改善正常细胞线粒体功能障碍和内质网应激。此外,在创伤性脑损伤小鼠模型中,汉黄芩素可通过Toll样受体4（TLR4）/NF-κB信号通路改善脑水肿和神经炎症反应,最终改善远期神经功能。前期有许多关于汉黄芩素与PPAR-γ信号通路的研究。例如:在酒精性肝病的研究中,汉黄芩素通过激活PPAR-γ信号通路,降低IL-1β和TNF-α的表达,从而减轻炎症反应。此外,在急性肺损伤的研究中,汉黄芩素通过PPAR-γ信号通路抑制NF-κB信号通路,进而抑制了脂多糖诱导的小鼠急性肺损伤和炎症。在肾脏肿瘤的相关研究中,汉黄芩素通过上调PPAR-γ的表达而减轻氧化应激及炎症反应从而发挥了肾脏保护作用。然而,关于汉黄芩素调控的PPAR-γ信号通路在脑出血中的相关研究还未见报道。本研究的主要目的是研究汉黄芩素在小鼠脑出血后能否增强小胶质细胞的吞噬作用从而加快血肿清除进而改善神经功能,并探讨汉黄芩素在小鼠脑出血后所介导的神经保护作用的分子机制,最终为治疗脑出血提供新靶点和新方法。实验方法第一部分采用经导管取左股动脉自体血,建立小鼠脑出血模型。成年健康雄性C57BL/6小鼠被随机分为假手术（Sham）组,脑出血+溶剂（ICH+Vehicle）组和脑出血+汉黄芩素（ICH+Wogonin）组。通过磁共振检查小鼠脑出血后1、3、7、14、28天血肿体积,通过蛋白免疫印记实验检测小鼠脑出血后1、3、5、7、14、28天吞噬相关蛋白AXL,Mer TK的表达水平,确定小鼠脑出血后研究时间点,通过免疫荧光检测Axl和Mer TK的分布情况,并通过免疫印记、免疫组化检测小鼠脑出血后脑组织中吞噬相关蛋白（AXL、Mer TK、CD36和LAMP2）的表达水平。第二部分确定小鼠脑出血研究时间点后,成年雄性C57BL/6小鼠被随机分为假手术（Sham）组,脑出血+溶剂（ICH+Vehicle）组和脑出血+汉黄芩素（ICH+Wogonin）组。在不同时间点评估各组小鼠脑出血后神经功能缺陷评分,通过免疫印记实验检测小鼠脑出血后脑组织中炎症因子（IL-1β、TNF-α）的蛋白表达水平,通过免疫荧光染色检测脑组织中M1、M2型小胶质细胞的表达水平,并采用尼氏染色观察各组小鼠基底节区存活神经元的情况,透射电镜观察髓鞘损伤情况。第三部分体内实验:成年雄性C57BL/6小鼠被随机分为假手术（Sham）组、脑出血+溶剂（ICH+Vehicle）组、脑出血+汉黄芩素（ICH+Wogonin）组、脑出血+PPAR-γ激动剂（ICH+Rosiglitazone）组和脑出血+汉黄芩素+PPAR-γ抑制剂（ICH+Wogonin+GW9662）组。体外实验:培养BV2细胞,给予100μM氧合血红蛋白（Oxy Hb）模拟体外脑出血,首先随机分为5组:对照组、溶剂组、汉黄芩素组、PPAR-γ激动剂组和汉黄芩素+PPAR-γ抑制剂组。通过实时荧光定量PCR检测各实验组小鼠吞噬相关蛋白基因（Axl、Mer TK、CD36及LAMP2）的转录水平,通过免疫荧光染色检测各实验组小鼠脑出血后脑组织Axl、Mer TK阳性小胶质细胞的比例。将PKH26标记的红细胞以10:1的比例（RBC:BV2）加入到不同组的BV2细胞中,通过蛋白免疫印迹实验检测Oxy Hb刺激下BV2细胞吞噬相关蛋白的表达水平;通过流式细胞术分析各处理组BV2细胞对红细胞的吞噬作用,通过免疫荧光观察各处理组BV2细胞对红细胞的吞噬情况。结果第一部分脑出血后,小鼠脑组织中吞噬相关蛋白Axl、Mer TK开始升高,第3-5天达到高峰。小鼠脑出血后第3天血肿体积减小,且ICH+Wogonin组的血肿体积较ICH+Vehicle组明显减少;脑出血后第3天,ICH+Wogonin组的吞噬相关蛋白Axl,Mer TK,CD36和LAMP2较ICH+Vehicle组明显升高。同时,汉黄芩素也增加了小鼠血肿周围Axl+、Mer TK+小胶质细胞比例。第二部分脑出血后第3天,ICH+Wogonin组神经功能评分明显优于ICH+Vehicle组。ICH+Wogonin组的脑组织中炎症因子表达水平量明显低于ICH+Vehicle组;ICH+Wogonin组脑组织M1型小胶质细胞数量明显少于ICH+Vehicle组,而M2型小胶质细胞数量明显多于ICH+Vehicle组,此外,神经元和髓鞘的损伤程度明显低于ICH+Vehicle组。第三部分体内实验表明,相较于溶剂组,汉黄芩素与PPAR-γ激动剂均显著增加了小鼠脑出血后脑组织中Axl、Mer TK阳性小胶质细胞的比例,同时提高了吞噬相关基因（Axl、Mer TK、CD36及LAMP2）的转录。而PPAR-γ抑制剂GW9662阻断了汉黄芩素的以上作用。体外实验表明,与溶剂组相比较,Oxy Hb+汉黄芩素组和Oxy Hb+PPAR-γ激动剂组BV2细胞Axl、Mer TK、CD36和LAMP2蛋白表达明显升高。Oxy Hb+汉黄芩素+PPAR-γ抑制剂组BV2细胞Axl,Mer TK,CD36和LAMP2蛋白表达与ICH+汉黄芩素组相比明显降低。此外,汉黄芩素组和PPAR-γ激动剂组BV2细胞吞噬红细胞能力强于溶剂组,而Wogonin+PPAR-γ抑制剂GW9662组BV2细胞吞噬红细胞能力明显降低。结论1.汉黄芩素在小鼠脑出血后增加脑组织中小胶质细胞吞噬相关蛋白的表达,加速了血肿清除。2.汉黄芩素在小鼠脑出血后诱导小胶质细胞向M2型极化,减轻了小鼠脑出血后神经炎症反应及氧化应激反应,进而减轻了血肿周围神经元和髓鞘的损伤程度,最终改善了小鼠神经功能。3.汉黄芩素通过PPAR-γ/CD36信号通路促进了小胶质细胞吞噬红细胞的能力,加快了脑出血后血肿清除进而减轻了继发性脑损伤。