第一部分c-Myc-microRNAs轴在氯化两面针碱诱导的CML细胞红系分化及凋亡中的作用及机制研究研究背景：慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于多能造血干细胞的恶性克隆性疾病,具有特征性的t(9；22)(q34；q11)染色体易位(Ph染色体)并形成BCR-ABL融合基因。该融合基因编码的蛋白具有极强的酪氨酸激酶活性,可抑制正常造血细胞分化和凋亡,最终导致白血病的发生。近年来,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors, TKIs)的应用较大的改善了CML的预后,但目前临床上TKIs的耐药问题日益严重。因此,寻找新的治疗方法仍是CML研究的主要方向之一。随着肿瘤发病学研究的深入,诱导分化疗法成为肿瘤治疗的新思路。全反式维甲酸在人急性早幼粒白血病的诱导分化治疗中已获得确切疗效,而目前慢性髓性白血病诱导分化治疗的研究还处于起步阶段,因此,研究CML细胞分化阻滞机制并寻找新的分化诱导剂对于CML的治疗具有重要意义。原癌基因c-Myc在细胞增殖、凋亡和分化等命运决定中起重要作用,其突变或异常表达与多种肿瘤的发生和发展密切相关。研究显示,c-Myc在CML急变期异常高表达并与不良预后相关。BCR-ABL可通过Jak2或MAPK信号通路上调c-Myc,过表达的c-Myc可拮抗伊马替尼(Imatinib, IM)诱导的CML细胞红系分化及凋亡,降低IM的药物敏感性。另有研究报道,c-Myc可影响多种microRNAs的表达,并通过他们发挥生物学效应。因此,靶向c-Myc-microRNAs轴可能成为CML诱导分化治疗的有效手段。氯化两面针碱(nitidine chloride, NC)是从广西特有药用植物两面针的根茎中分离的生物碱类。近年来研究发现NC可有效抑制乳腺癌和肾癌细胞的侵袭能力；在肝癌、胃癌、肾癌和鼻咽癌中,NC可以通过抑制增殖和诱导凋亡发挥其抗肿瘤效应。然而,NC在CML中的作用尚未见报道。研究目的：研究NC对K562细胞及原代CML细胞分化和凋亡的影响,阐明NC对c-Myc及c-Myc激活的microRNAs的影响,探讨NC作为治疗CML药物的可能性。研究方法：1.NC对K562细胞红系分化的影响：用不同浓度NC处理K562细胞后,应用联苯胺染色法检测细胞的分化率；流式细胞术检测红系分化抗原CD71和CD235a; Real-time RT-PCR检测红系分化指标；Western blot方法检测globin y蛋白水平。2.NC对K562细胞凋亡的影响：用不同浓度NC处理K562细胞24或48小时后,MTT法检测细胞存活；Annexin V/PI双染后流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测Caspase3和Parp-1等凋亡相关蛋白。3. C-Myc在NC诱导的红系分化及凋亡中的作用：首先应用Western blot和real-time RT-PCR检测NC对c-Myc蛋白和mRNA水平的影响；应用CHX chase实验检测NC对c-Myc蛋白降解的影响；构建高表达或敲除c-Myc的细胞系并用NC处理48小时,Western blot检测红系分化指标globin γ,流式细胞术检测细胞凋亡。4.NC对c-Myc降解的影响极其作用机制：只有Thr58磷酸化的c-Myc才能被E3泛素连接酶SCFFbW7识别并通过泛素-蛋白酶体降解,因此我们应用Western blot检测NC对c-Myc Thr58磷酸化水平的影响；在K562细胞中,转染野生型及T58A突变的c-Myc质粒并用NC处理后,CHX chase实验检测NC对野生型c-Myc及T58A点突变体降解的影响。5. C-Myc激活的microRNAs在NC诱导的红系分化及凋亡中的作用：应用Real-time RT-PCR方法检测NC处理或下调c-Myc对K562细胞中c-Myc相关microRNAs表达的影响；Western blot检测NC对miR-17/20下游靶基因P21的影响；Western blot检测miR-17/20对红系分化蛋白globin γ水平的影响,明确miR-17/20在NC诱导的红系分化中的作用；流式细胞术检测miR-17/20对NC诱导的凋亡的影响。6.NC对K562、K562/G01的IM敏感性的影响：用NC、IM或NC+IM处理K562细胞后,软琼脂集落形成实验观察NC、IM或二者联合作用对K562集落形成能力的影响；应用流式细胞术检测NC、IM或二者联合作用对K562和K562/G01凋亡的影响。7.NC对原代CML细胞的影响：收集5例CML患者骨髓,分离单个核细胞,其中病例1-3为IM敏感型,4和5为IM耐药型。流式细胞术检测NC对原代CML细胞的凋亡影响；Western blot检测NC对原代CML细胞中c-Myc蛋白表达的影响；Real-time RT-PCR检测NC对原代CML细胞中miR-17/20表达的影响。研究结果：1.NC对K562细胞红系分化的影响：应用联苯胺染色实验显示NC可明显增加K562细胞的分化率,且其诱导分化效应具有时间、剂量反应关系。流式细胞术结果显示NC可明显增加K562细胞表面红系分化抗原CD71、CD235a。Real-time RT-PCR结果显示NC可明显增加globin α、globin ε、globin γ、CD235a、AHSP等红系分化指标的mRNA水平。Western blot结果显示NC可明显增加K56细胞中globin y蛋白表达水平。2.NC对K562细胞凋亡的影响：MTT结果显示NC可抑制K562的生长。流式细胞术结果显示NC显著增加K562细胞的凋亡率,进一步研究发现NC影响K562细胞中Caspase-3、Parp-1等凋亡相关蛋白。3. c-Myc在NC诱导的K562红系分化及凋亡中的作用：原癌基因c-Myc通路在白血病细胞增殖、分化及凋亡等多种生物学行为中起重要作用,我们发现NC可下调c-Myc蛋白的表达,且具有时间、剂量反应关系。在K562细胞中,过表达c-Myc可逆转NC诱导的globin y上调,下调c-Myc可增强NC诱导的globin y上调；过表达c-Myc可逆转NC诱导的凋亡,下调c-Myc可增强NC诱导的凋亡。以上结果说明NC诱导的K562红系分化及凋亡是通过下调c-Myc起作用的。4.NC对c-Myc降解的影响极其作用机制：NC对c-Myc mRNA的影响不具有显著性,由此推测NC对c-Myc的调控发生在转录后水平。应用CHX chase实验显示NC可加快c-Myc蛋白降解。进一步研究发现NC可升高Thr58磷酸化的c-Myc与总c-Myc的比值,NC可加速野生型c-Myc的降解,而对T58A的c-Myc蛋白降解的影响不显著。以上结果说明,NC通过上调T58磷酸化加速c-Myc的降解。5.c-Myc激活的microRNAs在NC诱导的红系分化及凋亡中的作用：应用Real-time RT-PCR检测显示NC处理或下调c-Myc可抑制K562细胞中miR-17、miR-20a、miR-30a、miR-221、miR-222和miR-378的表达。Western blot显示NC可显著上调miR-17/20下游靶基因P21。进一步发现,miR-17和miR-20a上调可逆转NC诱导的globin γ水平升高及细胞凋亡,由此可见,NC诱导的K562红系分化及凋亡是通过下调miR-17、miR-20a起作用的。6.NC对K562、K562/G01对伊马替尼的敏感性的影响：NC、IM或联合(NC+IM)均可下调K562集落形成能力,且NC可增加IM的效力。K562/G01为伊马替尼不敏感,但NC对仍有杀伤作用,且NC可增加伊马替尼诱导的K562/G01细胞凋亡。7.NC对原代CML细胞的影响：NC可诱导原代CML细胞凋亡,并增加其对伊马替尼敏感性,更重要的是,NC对伊马替尼耐药的细胞仍具有杀伤作。NC可下调原代CML细胞中c-Myc蛋白及miR-17和miR-20a的表达。结论：1.NC可诱导K562细胞红系分化和凋亡；2.NC通过增加Thr58磷酸化水平加快c-Myc的降解,并可下调c-Myc激活的miRNAs:3.NC对伊马替尼耐药的K562/G01细胞及原代CML细胞仍有杀伤作用；4.NC可能成为一个新的抗白血病药物,为CML的治疗提供新的方案及实验室基础。第二部分Wnt通路分子FZD7在CML中的表达及其在骨髓基质细胞介导耐药中作用研究背景：伊马替尼(Imatinib, IM)是一种酪氨酸激酶抑制剂,能选择性抑制BCR-ABL的酪氨酸激酶活性,诱导大多数慢性期慢性髓性白血病(Chronic myeloid leukemia, CML)患者完全缓解。然而,随着IM在临床上的广泛应用和时间的推移,其耐药现象日益明显,复发率逐渐增高,因此研究CML耐药机制对于CML的治疗具有重要意义。越来越多的证据表明,血液系统肿瘤与其所处的骨髓微环境之间的相互作用在肿瘤耐药中起重要的作用。骨髓微环境的诸多成分中,骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesenchymal stem cells, BMSCs)是参与肿瘤生存及耐药的最重要因素。Gordon等研究表明BMSCs可通过直接接触及释放IL-6等可溶性细胞因子,减弱c-Kit抑制剂诱导的白血病细胞凋亡。Moshaver等同样发现,BMSCs可调节慢性淋巴细胞白血病(CLL)细胞中癌基因TCL1的表达,并激活TCL1相关的miRNAs,降低CLL细胞的药物敏感性。以上研究提示,靶向BMSCs与白血病细胞之间的相互作用可成为克服白血病细胞耐药的有力手段。白血病细胞与BMSCs之间的相互作用涉及多重调控机制和信号通路,其中Wnt/β-catenin信号通路是发现较早、研究较多的重要信号转导通路之一。Hu等研究发现,BMSCs可释放galectin-3分子,激活Akt信号通路使GSK3β失活,抑制β-catenin的降解,从而介导AML细胞耐药。另有研究显示,BMSCs可通过直接接触激活CML干细胞中的Wnt/β-catenin信号通路,维持CML干细胞的存活。由此可见, BMSCs可激活CML细胞中的Wnt信号通路,然而Wnt/p-catenin在CML细胞中激活的原因及调控机制目前尚不明确。FZD7属于frizzled受体家族,FZD7在肝癌、胃癌和乳腺癌等多种实体瘤中表达异常增加,且FZD7基因的表达水平与肿瘤的恶性程度和预后密切相关。此外,有研究报道,FZD7可调节耐药基因MDR1的表达参与肿瘤细胞耐药。我们发现,将BMSCs与CML细胞共培养后,CML细胞中FZD7表达增高。由此推测FZD7上调可能是共培养后Wnt/β-catenin信号通路激活的原因,靶向FZD7可切断BMSCs与白血病细胞之间的相互作用,或可成为克服CML耐药的有力手段。研究目的：研究FZD7在CML患者中的表达水平；探讨FZD7异常表达对白血病细胞药物敏感性及药物诱导凋亡的影响；阐明FZD7在BMSCs介导的IM耐药中的作用,为逆转IM多药耐药提供新的靶点。研究方法：1.收集16例初诊未经TKIs治疗的CML患者及6例正常对照骨髓标本,磁珠分选CD34+细胞,Real-time RT-PCR检测CD34+细胞中10种FZD分子的表达情况。16例CML患者根据治疗后情况,分为伊马替尼敏感(imatinib sensitive, IMS)组(9例)和伊马替尼抵抗(imatinib resistant, IMR)组(7例),分析两组间FZD7分子的表达差异。2.我们收集了3例CML(C1、C2和C3)及2例正常对照(N1和N2)骨髓标本,体外培养BMSCs细胞,并将其与CML细胞共培养后,Western blot方法检测CML细胞中FZD7、β-catenin口MDR1的等Wnt通路分子的蛋白水平改变；Real-time RT-PCR检测CML细胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、 Survivin、CD44和Trib2的mRNA水平的改变。3.包装携带FZD7 shRNA的慢病毒,感染K562细胞72小时后荧光显微镜观测感染效率,用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测病毒感染后FZD7下调情况。4.细胞增殖检测：MTT方法检测FZD7下调对细胞的增殖的影响；PI染色后利用流式细胞仪检测FZD7对细胞周期的改变。5.IM的敏感性检测：将感染后的细胞接种于细胞培养板中,加入不同浓度的IM,培养48或72小时,MTT方法检测细胞对IM的敏感性,计算伊马替尼的半数抑制浓度(IC50)；AnnexinV/PI双染后利用流式细胞仪检测细胞凋亡率的变化。6.将感染了ShFZD7-2或ShCtrl慢病毒的K562细胞与不同来源的BMSCs共培养48小时后,采用标准洗涤方法收集共培养后的K562细胞,加入伊马替尼(0.2μM)处理48小时,应用MTT检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡情况。7.用ShFZD7-2或ShCtrl慢病毒感染K562细胞72小时后,与不同来源的BMSCs共培养48小时后,采用标准洗涤方法收集共培养后的K562细胞,应用Western blot和Real-time RT-PCR检测FZD7及Wnt下游基因的表达情况。研究结果：1.CML患者中FZD7表达情况：相对于正常CD34+细胞,CML CD34+细胞中FZD7表达升高。Real-time RT-PCR结果显示伊马替尼抵抗组(IMR,7例)FZD7表达水平明显高于伊马替尼敏感组(IMS,9例)。Western blot检测3例正常对照骨髓、3例IMS和3例IMR的CD34+细胞中FZD7表达水平,IMR CD34+细胞中FZD7蛋白水平明显高于IMS组,与Real-time RT-PCR结果一致。2. BMSCs与CML细胞系K562及原代CML细胞直接共培养后,K562及原代CML细胞中FZD7、β-catenin和MDR1的蛋白表达水平较单独培养组明显升高,并且CML来源的BMSCs较正常对照来源的BMSCs对CML细胞中Wnt/β-catenin信号激活更为显著。此外,Real-time RT-PCR结果显示BMSCs与CML细胞系K562共培养后,CML细胞中FZD7及Wnt下游基因MDR1、c-Myc、Survivin、CD44和Trib2的mRNA表达水平较单独培养组亦明显增高。3.包装FZD7 shRNA慢病毒并感染K562细胞72小时后,荧光显微镜观察感染效率达95%以上,Real-time RT-PCR和Western blot结果显示携带FZD7 shRNA的慢病毒可有效下调FZD7表达。4.FZD7下调抑制CML增殖：MTT结果显示,FZD7干扰组的增殖速率显著低于对照组。流式细胞术检测细胞周期结果显示,干扰组G0/G1期细胞比例明显高于阴性对照组。利用Western blot检测细胞周期蛋白表达发现,阻断FZD7可升高CML细胞中P21、P27并降低Cyclin D1和CDK4的表达水平。5.FZD7下调增加CML细胞对伊马替尼的敏感性：MTT检测发现,干扰FZD7表达后K562细胞对IM的敏感性的增加。流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,下调FZD7后IM的诱导凋亡率显著升高。Western blot结果表明FZD7干扰组caspase 3及PARP-1的活性片段表达上调。6.FZD7下调能减少BMSCs诱导的伊马替尼耐药：MTT结果显示,FZD7下调显著抑制BMSCs诱导的IM耐药。流式细胞术检测细胞凋亡发现,在共培养的K562细胞中下调FZD7后IM的诱导凋亡率显著升高。7.FZD7下调能减少BMSCs诱导的Wnt/β-catenin信号通路激活：Western blot结果显示,FZD7下调能有效逆转BMSCs诱导的FZD7和MDR1蛋白上调；Real-time RT-PCR检测结果显示,FZD7下调能抑制BMSCs介导的MDR1和CD44 mRNA水平升高。由此可见,FZD7高表达可能是共培养后Wnt/p-catenin信号通路激活的原因。结论：1.相对于正常CD34+细胞,CML CD34+细胞中FZD7表达上升；IM抵抗型CML患者FZD7表达水平显著高于IM敏感型。2.CML细胞与BMSCs共培养能上调CML细胞中FZD7的表达,激活Wnt/p-catenin信号通路。3.FZD7下调抑制CML细胞增殖和集落形成能力,增强对IM的敏感性。4.靶向FZD7可有效阻断BMSCs与CML细胞之间的联系,逆转BMSCs介导CML耐药。