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目的:研究异牡荆素（isovitexin from Hydrocotyle sibthorpioides,IVT）对急性肝损伤（acute liver injury）肝细胞凋亡、氧化应激、脂质过氧化、炎症反应相关信号通路及蛋白表达的影响,探讨IVT对硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）诱导的小鼠急性肝损伤的保护作用机制。方法:1.急性肝损伤小鼠模型的制备90只雄性SPF级C57BL/6小鼠（22±2g,6-8周龄）,随机分为6组（15只/组）:正常对照组、IVT对照组（100 mg/kg IVT）、硫代乙酰胺（thioacetamide,TAA）模型组、阳性组（TAA plus175 mg/kg联苯双酯）、IVT治疗组（TAA plus 25、100 mg/kg IVT）;将IVT和联苯双酯滴丸溶解生理盐水中,充分混匀。除正常对照组和TAA模型组外,其余各组均给予不同剂量的IVT或联苯双酯1次/d,共15 d;正常对照组和TAA模型组均给予等量的生理盐水,连续15d（i.g.）。在预处理结束时,给TAA模型组、阳性组和IVT治疗组的小鼠注射200 mg/kg的TAA（i.p.）;24小时后,采集血液和肝脏样本以作进一步研究。2.IVT对急性肝损伤小鼠肝脏损伤的影响试剂盒检测IVT对小鼠血清中谷草转氨酶（Aspartate aminotransferase,AST）、谷丙转氨酶（Alanine transaminase,ALT）水平的影响;H＆E和Masson染色检测小鼠肝细胞结构病变及胶原形成情况。3.IVT对急性肝损伤小鼠氧化应激及脂质过氧化的影响试剂盒检测小鼠肝脏组织中超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、丙二醛（Maleic diadehyde,MDA）、谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase,GSH-Px）及还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量。4.IVT对急性肝损伤小鼠炎症反应的影响ELISA试剂盒检测小鼠肝组织中TNF-α、IL-6、IL-10及IL-1β的含量。5.IVT对急性肝损伤小鼠肝细胞凋亡的影响TUNEL染色观察小鼠肝细胞凋亡情况;RT-q PCR法检测肝组织小鼠凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3/8/9 m RNA的表达;Western blot法检测小鼠肝组织凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase 3/8/9的表达情况。6.IVT对TLR4/NF-κB信号通路蛋白及基因的影响RT-q PCR法检测肝组织NF-κB p65、IκB-α、TLR4 m RNA表达情况;Western blot法检测肝组织NF-κB p65、p-NF-κB p65、IκB-α和p-IκB-α、My D88和TLR4蛋白的表达情况。7.IVT对PI3K/Akt信号通路蛋白及基因的影响RT-q PCR法检测肝组织Akt、PI3K p85 m RNA的表达;Western blot法检测肝组织Akt、p-Akt、m-TOR、p-m TOR、p-P70S6K、P70S6K、p-PI3K p85、PI3K p85、PTEN蛋白的表达。结果:1.IVT改善TAA诱导的小鼠急性肝损伤本研究采用腹腔注射TAA诱导C57BL/6小鼠24 h,复制急性肝损伤模型。结果显示,与正常对照组及IVT对照组相比,TAA模型组小鼠血清AST和ALT水平均显著升高（P＜0.05）;在实验取材阶段肉眼观察新鲜小鼠肝脏可见,正常对照组和IVT对照组的肝脏表面呈红褐色,外观光滑,质地柔软。而TAA模型组肝脏表面粗糙,有大量弥漫性颗粒,而联苯双酯和IVT能以剂量依赖的方式显著改善TAA引起的这类病理症状。H＆E和Masson染色结果显示,IVT（25、100 mg/kg）治疗可以明显改善肝组织细胞损伤,胶原沉积等TAA所致的组织病理学改变。2.IVT减轻TAA诱导的小鼠氧化应激及脂质过氧化与正常对照组比较,TAA模型组小鼠肝组织MDA活性明显升高,SOD活性显著降低,经过IVT治疗后,MDA活性显著下降（P＜0.05）,SOD水平显著上升（P＜0.05）。此外,TAA模型组中肝组织抗氧化酶GSH-Px、GSH活性明显降低,IVT治疗可显著升高GSH-Px、GSH水平（P＜0.05）。表明IVT减轻TAA所致的急性肝损伤,可能是通过抑制脂质过氧化和氧化应激来实现的。3.IVT减轻TAA诱导的小鼠炎症反应ELISA反应检测结果提示,相对于正常对照组而言,TAA模型组小鼠肝组织中IL-6、IL-1β和TNF-α含量均显著升高而IL-10显著降低,给予IVT处理后,IL-6、IL-1β和TNF-α的含量均显著降低且IL-10的含量显著升高（P＜0.05）。RT-q PCR实验也显示出类似的结果,IVT治疗能显著降低IL-6、IL-1β和TNF-α的基因表达水平而显著升高IL-10的基因表达水平（P＜0.05）。4.IVT抑制TAA诱导所致的小鼠肝细胞凋亡通过TUNEL染色检测肝细胞凋亡,结果可见,TAA模型组中组可见大量阳性肝细胞。相反,经过联苯双酯和IVT处理后,阳性肝细胞数量明显减少。Western blot实验也显示出相似结果,检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8、caspase-9的表达。TAA模型组中Bax、caspase 3、caspase8、caspase 9表达上调,Bcl-2表达明显下调。IVT处理后,这些凋亡相关蛋白的异常表达得到明显逆转（P＜0.05）。结果表明,IVT通过调节caspases和Bcl-2家族来减少TAA诱导的小鼠急性肝损伤肝细胞凋亡。5.IVT抑制PI3K/Akt信号通路蛋白及基因的表达Western blot结果显示,TAA模型组中Akt、PI3K表达上调,而治疗组表达下调,说明IVT可显著抑制PI3K/Akt信号通路的激活。为了进一步阐明IVT在这一途径上的调控机制,我们检测了PI3K/Akt相关基因和蛋白的表达。Western blot结果显示,TAA模型组中m-TOR和P70S6K的磷酸化水平以及PTEN蛋白的表达水平均显著升高,但这些蛋白的表达水平在给予IVT处理后呈剂量依赖性下降（P＜0.05）。同样的,RT-q PCR结果显示,TAA刺激可显著提高PI3Kp85、Akt m RNA水平,而IVT处理可显著抑制这些基因的m RNA水平（P＜0.05）。以上结果均表明,IVT可以抑制PI3K/Akt信号通路。6.IVT抑制TLR4/NF-κB信号通路蛋白及基因的表达Western blot结果显示,与正常对照组相比,TLR4、My D88、IκBα、p-IκBα的表达经TAA刺激后显著上调。然而,IVT处理可显著抑制这些蛋白的表达。此外,在这一过程中进一步检测NF-κBp65在细胞核和细胞质的表达。结果显示,TAA刺激促进了转移NF-κBp65从胞质向胞核转移,但IVT治疗可以减弱NF-κBp65向胞核转移的趋势（P＜0.05）。此外,RT-q PCR实验也显示了同样的趋势,IVT治疗明显减少TLR4、NF-κBp65 m RNA的表达（P＜0.05）。以上结果均表明,IVT减轻TAA诱导的肝损伤可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路。结论:IVT能减轻TAA诱导所致的小鼠急性肝损伤,其作用机制可能是:（1）IVT能够减轻氧化应激、提高抗氧化能力;（2）IVT抑制TLR4/NF-κB信号通路蛋白的表达,从而抑制炎症反应的发展进程;（3）IVT抑制PI3K/Akt信号通路蛋白的表达,从而减少肝细胞凋亡。