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目的:应用蛋白质组学、转录组学技术、体内和体外试验分析黄芩黄连药对（Scutellaria coptis herb couple,SC）对非酒精性脂肪性肝炎（Non-alcoholic steatohepatitis,NASH）相关氧化应激、炎症的影响,进一步研究其作用机制。方法:1.SC在大鼠肝组织水平上的蛋白质组学和转录组学研究。在课题组前期已发表论文的动物实验基础上选取组织样本进行实验,肝脏病理结果表明大鼠NASH模型构建成功,SC有效改善NASH。样本选取空白组（C）、模型组（M）、SC高剂量组（SC-H,11.2 g/kg·d）。（1）提取肝组织蛋白样品进行前处理,用LTQ-Orbitrap静电场轨道阱液质联用检测,对筛选得到的差异表达蛋白（differentially expressed protein,DEPs）进行KEGG、GO富集分析,挖掘SC对于NASH可能存在的作用机制。（2）提取肝组织RNA,通过转录组学测序技术,对筛选得到的差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）再进行KEGG、GO富集分析,探究SC对于NASH可能存在的作用机制。（3）q RT-PCR法检测大鼠肝组织中Nrf2、HO-1、KEAP1、NF-κB、NQO1、SOD的m RNA表达水平。2.采用转录组学和蛋白质组学技术研究SC对FFA诱导Hep G2细胞NASH模型的影响。（1）通过1m M游离脂肪酸（Free fatty acid,FFA）模拟NASH体外脂质代谢环境,并加入SC含药血清和白藜芦醇共同干预24 h。将细胞分成3组:空白组（C）;模型组（M）;SC含药血清高剂量组（SC-H）。（2）通过加入TRIzol提取,各组肝细胞中的RNA,通过转录组学测序技术,对检测得到的DEGs再进行KEGG、GO富集,以解析SC作用于NASH的潜在靶点和途径。（3）造模给药后,加入RIPA强裂解液提取各组的肝细胞蛋白,预处理后进行液质联用检测,对筛选得到的DEPs进行KEGG、GO富集分析,分析SC作用NASH的潜在靶点和通路。3.SC对NASH中Nrf2/TXNIP/NLRP3信号通路介导的抗氧化应激以及抗炎的作用机制研究。把Hep G2细胞和RAW264.7细胞各分成6组:空白组（C）;模型组（M）;SC含药血清高、中、低三剂量组（SC-H、SC-M、SC-L）;白藜芦醇组（R）。（1）利用1 m M FFA诱导Hep G2细胞模拟体外NASH环境,加入SC含药血清和白藜芦醇,脂质染色、检测TG含量。（2）流式细胞术测定ROS浓度。（3）试剂盒测试各组细胞中MDA、SOD和GSH-PX。（4）WB法测定细胞内Nrf2（Nfe2l2）和TXNIP蛋白表达水平。（5）PCR法测定了各组细胞的Nrf2（Nfe2l2）、NF-κB、HO-1、KEAP1、NQO1、SOD、TXNIP、NLRP3、ASC和IL-1β的m RNA表达水平。（6）LPS（0.1μg/ml）诱导RAW264.7细胞形成体外炎症模型,给药组给予不同浓度的SC含药血清和白藜芦醇进行干预,q RT-PCR法检测各组RAW264.7细胞中Nrf2、NQO1、TXNIP、NF-κB、NLRP3、ASC的m RNA表达水平。（7）细胞转染小分子干扰核糖核酸（si RNA）沉默Nrf2,Nrf2-si RNA影响SC对NASH的作用。Nrf2-si RNA转染Hep G2细胞后,将细胞随机分为:（1）si NC组（转染NC-si RNA,无沉默作用）:空白组（C-si NC）、模型组（M-si NC）、含药血清高中低三个剂量组（SC-H-si NC、SC-M-si NC、SC-L-si NC）、白藜芦醇组（R-si NC）。（2）si Nrf2组（转染特异性针对Nrf2的si RNA）:含药血清高中低三个剂量组（SC-H-si Nrf2、SC-M-si Nrf2、SC-L-si Nrf2）;白藜芦醇组（R-si Nrf2）。沉默Nrf2后,再次染色检测细胞内脂肪含量;用流式细胞术检测每组ROS含量;ELISA法检测IL-1β在细胞培养上清中的浓度;WB法测定Hep G2细胞内Nrf2和TXNIP蛋白表达;PCR法测定了各组Nrf2、TXNIP、NLRP3、ASC和IL-1β的含量。结果:1.（1）经过肝组织转录组学分析,我们找出SC与NASH相关的DEGs有Nrf2（Nfe2l2）Ptgs2（COX2）、Gpx2、Txn1、Il1b、Cxcl1、Ccl3、Olr1、Trem2、Igfbp6、Ccl2、Maff、Hspa1b、Junb、Atf3、Ccrl2、Nfkbiz、Tubb2a、Clec7a、Il15、Traf3、Casp1、Atf4、Lcn2Cryab、Sharpin、Traf6、Itpkc、Nfkb2、Cpt1a、Ccl4、Hmgcr、Ddit3、Card6、Relb、Ndufs1Cebpb、Ifrd1、Mcu、Sdc4、Egr1、Gsk3b、Traf2、Cd74、Trib1、Trim25、Gclm、Gsta1、Cyp2e1、Hsp90aa1、Itch、Grb2、Gpt2、Ikbkg、Insr、Gpx3、Mapk8、Ube2z、Mfn2、Hif1anPpara、Rxra、Atf6,DEGs主要参与了氧化应激、炎症、胰岛素抵抗（insulin resistance,IR）信号通路等。（2）经过肝组织蛋白质组学分析,SC和NASH相关的DEPs中有AcadmCpt1a、Echs1、Fbp1、Acsl1、Adh1、Aldob、Cat、COX2、Cps1、Cyp1a2、Cyp2c11、Eef1a1Eef1a2、Fasn、Gapdh、Glo1、Gsta4、Hmgcs2、Hsp90b1、Hspa8、Ide、Ldha、Ldhb、Mat2aNdufb8、Prdx6、Tuba8、Vcp,主要参与了氧化应激、脂质代谢通路等。（3）q RT-PCR法检测Nrf2通路相关基因,在大鼠肝组织中的表达量:与空白组相比,模型组肝组织Nrf2、HO-1、NQO1和SOD的m RNA表达量显著减少,KEAP1、NF-κB的m RNA表达量显著增多;SC与白藜芦醇干预后Nrf2、HO-1、NQO1和SOD的m RNA表达均明显上升,KEAP1NF-κB的m RNA表达量显著减少。2.（1）经过Hep G2细胞转录组学分析,我们找出SC与氧化应激相关的DEGs有IL11、GCLM、FGF2、HMOX1（HO-1）、SQSTM1、TXNRD1,主要参与了TNF-α、Toll样受体等炎症通路等。（2）经过Hep G2细胞蛋白质组学分析,我们找出SC与NASH相关的DEPs有TUBA1A、CDKN1B、PKM、YWHAB、YWHAZ、AKR1A1、ENO1、LDHB、H3F3B、HSP90B1、HSPA1A、HNRNPA1,主要参与了糖脂代谢等。3.（1）油红O染色结果:结果显示,FFA成功诱导HepG2细胞模拟体外类脂代谢坏境。相比空白组,模型组显微镜视野内细胞周围环绕大量红色脂滴;SC和白藜芦醇干预后模型组细胞周围的红色脂滴数量显著减少。进一步使用ELX800吸收光酶标仪（Bio Tek）对细胞内脂肪定量分析,模型组脂肪含量增多;SC和白藜芦醇减少细胞内TG、脂肪含量。（2）试剂盒方法检测结果:与空白组比较,模型组TG、MDA浓度明显提高、SOD和GSH-PX活力值显著下降,SC和白藜芦醇干预后减少了TG、MDA浓度、提高SOD和GSH-PX活性。（3）流式细胞术结果:相比空白组,模型组ROS百分比明显提高;SC和白藜芦醇干预后减少ROS的百分比。（4）Western Blot结果:相比空白组,模型组Nrf2蛋白水平下降,TXNIP蛋白水平增加。SC干预后,Nrf2蛋白水平升高,SC降低TXNIP蛋白表达。（5）q RT-PCR结果（Hep G2细胞）:相比空白组,模型组Nrf2、HO-1、SOD的m RNA水平降低,Keap1和NF-κB的m RNA水平升高;SC和白藜芦醇升高Nrf2、HO-1、NQO1、SOD的m RNA表达,降低NF-κB、Keap1的m RNA表达。（6）PCR结果（RAW264.7细胞）:相比空白组,模型组Nrf2、HO-1、NQO1、SOD的m RNA含量明显降低,升高了TXNIP、NF-κB、Caspase-1、NLRP3和ASC的m RNA含量。SC和白藜芦醇干预后提高了Nrf2、NQO1、HO-1、SOD的m RNA表达;下调了TXNIP、NF-κB、ASC、Caspase-1、NLRP3的m RNA含量。（7）细胞转染小分子干扰核糖核酸（si RNA）,沉默Nrf2后,SC对NASH的影响。转染Nrf2 si RNA的数据表明,SC抑制ROS生成、降低炎症因子和改善脂质沉积的作用,被Nrf2 si RNA抵消。si RNA各组由于Nrf2 si RNA,细胞脂肪含量升高、炎症因子水平显著升高和ROS生成显著增多。Nrf2 si RNA显著降低Nrf2的表达水平,显著升高TXNIP、NLRP3、ASC和IL-1β的表达水平。结论:1.通过对NASH模型大鼠肝组织的转录组学、蛋白质组学研究,表明SC可能是通过氧化应激（Nrf2信号通路）或炎症等相关信号通路来影响NASH。2.通过对Hep G2细胞NASH体外模型的转录组学、蛋白质组学研究,发现SC可能是通过氧化应激、脂质代谢相关信号通路来影响NASH。3.SC可以减弱FFA诱导的Hep G2细胞脂肪变性,减少RAW264.7细胞内炎症因子水平;降低Hep G2细胞ROS的百分比,提高SOD、GSH-Px活性,激活Nrf2信号通路,从而增强细胞的抗氧化功能并缓解炎症。转染Nrf2-si RNA后发现,SC对ROS及其炎症因子所致的细胞损害产生了保护功能,其作用机理是通过Nrf2/TXNIP/NLRP3信号通路,达到改善氧化应激和炎症反应的目的,最终改善NASH。